一种具有高比活性的新木聚糖酶地研究.pdfVIP

～种具有高比活性的新木聚糖酶的研究 姚斌 中国农业科学院饲料研究所，北京、100081 olivaceoviridis A1)。从它的培养液中分离纯化出两种木聚糖酶：43kD的XYNA 5．72 胃蛋白酶、胰蛋白酶处理30分钟，对酶活性无影响。XYNA的比活性为252 U／mg。 无纤维素酶活性。胃蛋白酶、胰蛋白酶37℃下处理30分钟，对酶活性无影响。 酶。 进一步克隆了这2种酶的编码基因，并在大肠杆菌中进行了表达，表达产物 具有正常的生物学活性。这2个基因的序列测定结果表明，砂以与发表的编码 FXYN的基因序列完全一样， 1组木聚糖酶。 酸，理论分子量为20．839kD属于G／1 高效表达高比活木聚糖酶是迸一步提高木聚糖酶发酵效价、降低其生产成 olivaceoviridis 本的有效途径。将橄榄绿链霉菌Streptomyces A1的高比活木聚糖 酶成熟蛋白编码基因xynB克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中，转化毕赤酵母得 到重组酵母，在重组酵母中木聚糖酶基因得到了高效分泌表达，且表达产物具有 生物学活性。在3升发酵罐中蛋白表达量约1．4mg／mL，酶活性(效价)为 三者在比活性、Vmax及热稳定性方面有较大差异，尤其是酶的比活性仅为原酶的 三分之一。该酶对不同木聚糖的酶解产物的糖份分析表明：酶解产物的主要成分 为木二糖、木三糖和木四糖，占总糖含量的95％以上。我们正从两方面着手进一 步提高其表达水平。】．提高木聚糖酶蛋白的表达量。一方面进行xynB基因的密 码子优化，xynB基因的G+C含量高达64．3％，其密码子选择偏向与毕赤酵母中高 表达基因的相差很大；另一方面是提高xynB基因在重组酵母中的基因拷贝数，目 blotting分析证实)， 前构建的各重组酵母xynB基因拷贝数均为1个(通过Southern 通过采用高拷贝载体和应用酵母原生质体转化方法，可提高拷贝数，从而提高蛋 白表达量。2．研究解决在酵母中表达后XYNB比活性下降的问题，还有望进一步 提高此酶在重组酵母中表达的酶活性。通过以上方法，XYNB的发酵效价应还有 提高6～10倍的潜力。 对XYNB进行了3级结构的预测，以此为基础，尝试了通过定点突变进一步 对XYNB进行改良，通过一个氨基酸位点的突变，使酶的热稳定性得到了提高，在 2lO 70。C处理10分钟后，酶活性由原来的13．6％剩余酶活性提高到70％．而酶的最适 温度并未改变。酶性质改良方面的进一步工作正在进行当中。 21l