荧光示踪技术在酵母转化的研究中的应用.pdfVIP

荧光示踪技术在酵母转化研究中的应用 监莲，郑鹤志，刘茴茴，鲁哲学，庞代文‘，谢志雄 (武汉大学化学与分子科学学院，武汉，430072) cerevisia的转化，使用最普遍最有效的转化方法中包含 对于完整酵母Saccharomyces 有u+和PEG．这种方法因为简单、方便且具有很高的转化效率，被绝大多数的实验室所 采用1。但是到目前为止，关于Li+和PEG在完整酵母转化中的作用以及质粒DNA是如 何进入酵母细胞仍然未见报道。阐明质粒DNA是如何进入完蹩酵母不仅对于优化酵母转 化方法有重要的意义，对于细胞尤其是真核细胞摄取大分子的过程的理解和真核生物的 水平基因转移机理的理解也有着极为重要的作用。我们基于荧光示踪技术，采用流式细 胞仪考察了完整酵母中Li+、PEG对DNA在细胞表面的结合以及对细胞通透性的影响。 同时为进一步阐述Li+和PEG在完整酵母转化中的作用，采用FM．AFM和SEM以及通 过考察酵母转化效率的变化，对Li+和PEG．在完整酵母和去壁酵母即原生质体摄取DNA 中的作用进行了研究，并提出一种酵母基因转化的机理。 荧光试剂YOYO．1标记DNA2，借助流式细胞仪研究了Li‘和PEG在完整酵母中对 DNA在细胞表面结台以及对细胞通透性的影响(如图I)。结果表明，对于完整酵母， DNA在酵母表面具有结合点，其结合点的 数目是有限的．且在DNA过量时能够达 到饱和；Lr对DNA结合到酵母表面的作 用很小，而对细胞通透性却有很大的影 响；PEG的作用在于诱导DNA结合到细 胞表面，并同时对细胞的通透性有很大的 影响。Lj+和PEG的同时存在具有协同作 用，它能够使DNA在酵母表面的结合和 细胞的通透性达到极大值。 为了更详细的研究“+和PEG在完整 酵母转化中的作用，我们同时还用荧光倒 置显微镜，原子力显微镜和扫描电子显微 镜实时、直观形象的观察到这两种离子对标记了荧光物质YOYO．I的DNA在完整酵母 和原生质体表面的吸附以及酵母表面形貌的影响，并研究了“+和PEG对完整酵母和原 生质体的转化效率的影响，从而发现DNA吸附到细胞表面和DNA转化进入细胞之间的 必然关系。 荧光成像试验(如图2)表明PEG对于质粒DNA吸附到完整酵母或原生质体表面是必 须的。在完整酵母或原生质体中，没有PEG，细胞表面几乎观察不到有DNA的吸附；只 有在有PEG存在的条件下，DNA才能在细胞表面产生吸附，因此我们认为PEG处理是 质粒DNA成功的吸附到酵母表面的基本要求。在酵母转化中，PEG的主要作用在于诱导 ’通讯联系人：庞代文，Tel：027—687S6759 267 质粒DNA吸附到细胞表面，也可能对于DNA进入细胞内部有一定的促进作用，而决不 仅仅是诱导细胞膜融合3。至于L．+的作用，我们在试验中发现Li+离子极大增加了质粒 DNA在完整酵母表面的结合点，而对原生质体表面质粒DNA的吸附却没有明显的影响。 这样的结果表明，“+离子仅对细胞壁有影响，因为原生质体和完整酵母的唯一区别就在 于完整酵母有细胞壁而原生质体没有。我们可以认为对于完整酵母，Li+离子的作用在于 增加了细胞壁的通透性，使得更多的细胞膜能够暴露出来结合质粒DNA，然后质粒DNA 在PEG的作用下结合到细胞膜上。 StainedDNAS咖ncdDNA+Li’StainedDNA+PEG StaincdDNA+U++PEG Fig．2stainedDNAblndjIlgtocellsurfaces(firstline amintactyeastcells．secondlinealeprotoplasts) Li+和PEG对pAJl61DNA在完整酵母和原生质体中转化频率影响的研究表明：完 整酵母的转化频率远远的小于原生质体的转化频率，说明细胞壁在酵母转化中是起阻碍 作用的。Li+离子处理能够极大的增加完整酵母的转化频率，而对原生质体的转化频率没 有显著的影响，这和荧光试验即u+处理使完整酵母表面的DNA结合点极大增加使完全 一致，更进一步证实了Ij+仅对细胞壁有影响。至于PEG的作用，不管在完整酵母还是