转染RA538基因抑制人肺腺癌与人结肠癌细胞生长作用的研究.pdfVIP

转染RA538基因抑制人肺腺癌和 人结肠癌细胞生长作用的研究国 邢嵘 (大连医科大学病理生理教研室，大连116027) 林晨牟巨伟程金科付明 吴 曼 (中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室，北京100021) 摘要RA538是从维甲酸诱导终末分化的人食管癌细胞系中分离出的一个与分化相关的 基因。通过重组体腺病毒将RA538基因转导到人肺腺癌细胞系(GLC-82)和人结 肠癌细胞系(HCr)中．获得较高的转导效率，显示出较明显的抑制肿瘤生长作用， 抑制率分别为77．2％和77．9％，并能降低两细胞系体内肿瘤形成能力。藏式细胞 计数、DNA片段化分析及TUNEL检测证实RA538可诱导肿瘤细胞发生凋亡。 Westem blot分析表明，RA538具有明显下调c-myc基因表达的作用。研究结果提 示，RA538是一个较广谱的抑癌基因，可以作为肿瘤基因治疗的一十新目的基因， 具有良好的应用前景。 关键词RA538；腺病毒载体；肿瘤基因治疗；细胞凋亡 目前恶性疾病的基因治疗仍处于不成熟的时期，要突破这种状态，必须在新概念上有所发 展【1]。医科院肿瘤研究所细胞生物室在多年从事癌变原理研究的工作中，利用消减杂交策 略，从维甲酸诱导分化后的人食管癌细胞中，分离到了一个与细胞分化相关的cDNA克隆一 导食管癌细胞发生终末分化和凋亡的作用【3】。为进一步确定RA538的抑瘤作用，本实验用腺 抑制作用，并研究其可能的抑瘤机制，为RA538作为肿瘤基因治疗的一个新的目的基因，提供 科学的实验依据。 1材料与方法 1．1细胞系和培养条件 清(天津生化制药厂)的M199(GIBCOBRL，美国)培养基在37C，5％coz条件下培养。 BRL，美国)的 293细胞：人胚肾细胞系，带有腺病毒E1基因，在含10％胎牛血清(GmCO 。车谭题受国家863高科技发展基金资助‘批准号BH-03-oI-02) 103 BRL，美国)培养基中培养。 高糖DMEM(GIBCO 1．2重组体腺病毒的扩增、滴度测定及转导效率的测定 ml，对照为Ad—LacZ滴度6，7×109PFU，ml。一70℃冰箱保存。 (2)病毒的扩增和滴度测定：按GrahamFL的方法进行【4]。主要程序为，重组RA538基 因的复制缺陷的腺病毒在293细胞中繁殖扩增，收集含有病毒的293细胞，离心．沉淀溶于 鉴定病毒的存在。扩增的病毒上清液按lO“6倍数稀释，再感染293细胞。48h后，选取出现 100％病变的病毒稀释度计算病毒的滴度。病毒效价可达3×10”PFu／ml。 细胞的百分率。 1．3细胞存活的观察 82细胞和HCT细胞中进行培养，以Ad—LacZ为对照，光镜下观察细胞形态的变化。 1．4 Westernblot分析 Westernblot Kit(Am∞hara公司)的程序进行Western Blotting，一抗为c-myc鼠抗人单克隆抗体。 1．s流式细胞计数分析 浓度100他／“)染色20～30rain，对照组为未经病毒感染的肿瘤细胞．在Coulter EpicsEsp流 。 式细胞仪(Coulteroom．美国)上进行分析。 1．6细胞DNA片段化分析 用1h，加蛋白酶K，37C，处理2h。冷乙醇沉淀DNA，TE溶解。在1％琼脂糖凝胶中电泳。 104