清开灵注射液和其有效成分诱导HL-60细胞凋亡的研究.pdfVIP

全田第三届中医肿瘤学术年会论文集2001年·郑州 清开灵注射液及其有效成分诱导 HL一60细胞凋亡的研究” 陈泽涛董倩山东中医药大学附属医院(250011) 近年来，清开灵注射液广泛用于临床多种疾病的治疗。已有研究表明，清开灵注射液有抗小鼠脑 膜自血病的作用。我们经过临床观察发现，清开灵注射液对化疗药物有增效减毒作用。为进～步探 讨清开灵盼怍用机理，我们又开展了清开灵注射液及其主要成分口曙自血病细胞凋亡的体外研究。 一、材料与方法 1．细胞HL一印细胞系(人急性早幼粒白血病细胞，山东省医学科学院免疫室提供)，37℃，5％ CO,温箱中，用古10％小牛血蒲的础．M11640(嘲啮，美国)培养液每2—3天传代培养。 2．药物制备‘i膏开灵注射液，北京中医药大学实验药厂生产，规格2Ⅱd『支，批号：9／010212。黄芩 甙，纯度粥．4％，牛黄胆酸。纯度势％。猪去氧胆酸，纯度95％。 3．药物对HL一60细胞敏感性的检测采用MTT法 4．细胞形态学变化药物作用终浓度为清开灵111200原液，黄芩甙8呵血，猪去氧胆酸200ug， 化。 5．DNA凝胶电泳观察提取各药物作用6小时后细胞的DNA，按文献略加改进进行电泳，阻 PBR322，l{inn(华美生物工程公司)作为Marker，紫外线灯下观察拍照。 x 6．流式细胞仪检测凋亡细胞数及细胞周期变化分别收集各药物作用6小时、24小时细胞1 l驴个，用流式细胞仪(美国BD公司)检测，进行细胞周期分析，低于cl期DNA含量的细胞为凋亡细 胞。 x 7．流式细胞仪检测bd一2蛋白表达的变化…收集各药物处理6小时后细胞11驴个，以bd一2， FITc抗体标记，上机检测。 二、结果与分析 1．各药物对HL一印细胞敏感性的作用。 801)时抑制率为90．67％，稀释200倍时缎胞全部死亡，说明清开灵在体外具有很强的细胞毒作用，呈 剂量依赖性。随着清开灵剂量增加，对HL一∞缀赡的增殖抑错增强。 图1不同荆量的清开灵注射液对HL一60细胞敏感性变化 (横坐标分母代毒稀释倍数，纵坐标为570rim一630rim的A值) ·197· 全国第三届中医胂寤学术年会论文集 2001年·郑州 (2)在清开灵的三种有效成分中，黄芩甙对HL一印细胞的抑制率最强，呈剂量依赖性，8u—ml的 药物浓度可抑制86．16％的细胞增殖，25u一Ⅱd时抑制率100％；猪去氧胆酸作用次之，抑制作用呈剂量 表现为呈剂量依赖性的抑制作用，I‰为姗u—d。 2．药物诱导HL一60细胞凋亡的观察 (1)细胞的形态学变化清开灵注射液(见图2)、黄芩甙、猪去氧胆酸均可在早期(6小时)即诱导 HL一60细胞凋亡，并出现典型细胞凋亡特征，随着时间的延长，凋亡小体释放，坏死细胞及继发于凋亡 的坏死细胞增多，胞膜不完整，出现大量细胞碎片。牛黄胆酸未见凋亡细胞出现，部分细胞体积增大、 膨胀，晚期可出现破裂、死亡。 图2细胞形态学变化 a细胞对照b清开灵6小时c清开曼24小时d清开灵48小时 解，电泳出现梯状条带。以清开灵、黄芩甙作用组DNA片断形成的条带最清晰，猪去氧胆酸组次之。 牛黄胆酸作用组DNA电泳未见梯状条带(见图3)。 图3各药物作用6小时后DNA凝胶电泳 a．Md口PBR322，Hinn d．}沓去氧胆酸200u#ml b．细胞对照c．牛黄胆酸200ugml f．清开灵注射液(Y．蜥^瓶盅) e．黄芩甙8吲llll (3)流式细胞仪检测细胞凋亡各药物作用6小时、