南极假丝酵母脂肪酶B的酵母表面展示的研究.pdfVIP

发酵工程学科的进展 ——第四班奎固发酵工程学术讨论奢论文采 南极假丝酵母脂肪酶B的酵母表面展示研究 潘志友， 叶燕锐，韩双艳，郑穗平，林影“ (华南理工丈学生物科学与工程学院，广摊510640) 摘要：在众多微生物脂肪酶中，南极假丝酵母脂肪酶B的用造最为广泛，它对非水洛性和 水{磐性物质都表现出更为出色的催化活性。丰实验从南极很丝酵母基因组扩增出CALB的 完整基目片段．插入到酵母表面展示载体质柱pieAS上葡萄糖淀粉酶信号肽及r凝集素C 墙序列之1回，形成融合表达框．构建重组质粒pICAS--CALB，该醯合蛋白基因受启动子 子，葡萄糖诱导表达后，进行脂肪酶活性测定。结果表明：CALB在酿酒酵母细胞表面得到 活性表达，细胞表面展示酶活为146．00U／“． 关键词：酵母表面展示；南极假丝酵母脂肪酶B；酿酒酵母；r凝集素 解，也能在非水相中催化酯合成反应、转酯化反应、酸解反应等。在众多脂肪酶中．南极 antarctica 假丝酵母脂肪酶B(CandidalipaseB。CALB)的用途最为广泛，它对非水溶 性和水溶性物质都有很强的催化活性。近几年的研究成果表明，cALB在酯化口]，水 解“，转酯o]，以及其他类型反应“1中都表现出比其它脂肪酶更为出色的催化活性。细 胞表面工程是近几年发展起来的一种外源基因表达体系，这一表达体系是通过将目标蛋 白基因与天然表面蛋白基因起锚定作用的结构域编码序列融合，形成融合表达框，同时 在上游加上信号肽序列实现目标蛋白在细胞表面表达。口3目前已报道的酵母表面展示系 统包括两类：凝集素系统和絮凝素系统。凝集素展示系统又分为a-凝集索系统和a一凝集 索系统。利用a一凝集索系统表面展示目的蛋白基因的一般结构是，将目的蛋白作为N端 与Q-凝集素c端部分融合，目的蛋白经a-凝集素展示于酵母表面，a-凝集素共价连接到 细胞壁的葡聚糖上，锚定区由蛋白质c端的320个氨基酸组成，富含Ser／Thr残基。口1本 实验利用a一整合型表面展示系统，构建重组载体plCAS—CALB，表达南极假丝酵母脂肪 酶B，以期为CALB定向进化，提高其酶活与底物选择性奠定基础。 1材料与方法 1．1材料 1．1．1菌株和质粒E romycescerevisiae)由日本京都大学植田充美教授馈赠。Candidaantarctica，宗敏华教 授馈赠。 ※联系人电子邮箱地址：feylin《gseut．edu．cn 潘志友等：南极假丝酵母脂肪酶B的酵母表面展示研究 1．1．2培养基及培养条件 南极假丝酵母斜面培养基：蛋白胨6g／L，酪蛋白水解物4g／L，酵母膏3g／L，牛肉 膏1．5g／L，葡萄糖lg／L，琼脂Z09／L，pH6．0 南极假丝酵母种子培养基；除去琼脂，其他成分同斜面培养基。 南极假丝酵母发酵培养基：黄豆粉40g／L，可溶性淀粉15g／L，橄榄油5mL／L． 1 K2HPq4g／L，MgSO_‘·7H20g／L，吐温一800．1％，酵母膏5g／L。pH6．0。24℃ 10 g／L，蛋白胨10g／L，NaCl 200rpm摇瓶培养54h。口1LB培养基：酵母提取物5 g／L。 根据需要添加50rag／mL氨卞青霉素。 YPD培养基：酵母提取物10g／L．蛋白胨20g／L，葡萄糖20g／L。 20 20 20 SF-W培养基：Leu30mg／L，Hismg／L．Ade 6．7 mg／L，Uramg／L，YNB g／L，果糖20g／L。 Leu 20 20