Bacillus+sp.Strain+EB-87酯酶的酶学性质的研究.pdfVIP

Bacillussp.StrainEB一87醋酶的酶学性质研究 汪钊 李光伟 郑裕国 (浙江工业大学生物与环境工程学院，杭州 310014) 摘要 研究了Bacillussp.Strain.EB-87酣醉的醉学性质 (包括降作用最适pH,醉作用最适沮度、醉的 pH穗定性、热德定性、金属离子时醉活的影响)、醉的动力学以及对不同破桩长短的漪类、不同的脂 肪酸酣的底物特异性。为Bacillussp.StrainEB-87能醉的进一步应用打下基础。 类任伺 漪醉 脂肪醉 分离 纯化 性质 微生物醋酶 (Esterase,EC3.1.1.1)作为重要的工业酶类，广泛应用于医药、化工、食品等 行业，特别是在医药化工和有机合成工业，如立体异构体的转化和拆分、醋合成、内醋合成、 醋交换、多肤合成等催化反应中I’一」‘。它与脂肪酶的差异主要在于作用底物的碳链长短不同:脂 肪酶优先水解长链醋类，醋酶则优先水解短链的醋类;二者的差异还在于所要求的底物的物理 状态的不同，即脂肪酶专门在异相系统 (油— 水的界面)上作用，酷酶与其他水解酶的作用 方式相同，只作用于水溶性的底物171酉旨酶作为生物催化剂，具有反应条件温和、方法简便、催 化活性高、反应不需要辅酶、选择性强、产物易于分离、回收等优点，与传统的化学反应相比 具有明显的优越性。利用其特异性水解反应，特别是其中的大多数反应具有不对称性，可以专 一地用于制备许多利用化学法难以合成地手性化合物，如光学活性药物、食品及饲料添加剂、 液晶、农药等及其它们的前体，具有很好的应用价值。 材料与方法 菌种来源土坡中筛选得到的Bacillussp.StrainEB一87菌株。 1.2Bacillussp.StrainEB一87酣酶的分离、纯化 将发醉液在49C，转速15000rpm下，离心15min，收集上清液。并在4℃下，于上清液中缓 慢地加人固体硫酸按达60%左右的饱和度，边加边搅拌。采用真空抽滤器抽滤之后，取出加适 当的水使之溶解。再将上述处理过的酶液装人由半透膜制成的透析袋内，为了不使酶失活和提 高透析的速度以加快吸取溶剂，将该透析袋埋人分子量为25,001)的PEG中，透析过程在4℃下 进行，除去酶液中的盐类、有机溶剂及低分子量抑制剂等，再通过超滤进一步浓缩。经过以上 离心 (centrifugation),盐析 (saltout)、透析 (dialysis)和超滤 (ultrafiltmtion)操作分离提纯后的 酶即为实验所需用酶，放人冰箱4℃保存以备用。 1.3 醋酶峥活力浏定方法 将酶液离心取上清夜与含1mmol/1对硝基苯乙酸醋的Tris一HCl缓冲液 ((0.05moU1,pH二7.2) lOml和酶液2ad混合，置于40℃水浴振荡反应器中振荡反应10min，经酶解后，所释放出的对硝 基苯酚用分光光度计在波长400n.处测定。 酶活力单位定义为:每毫升酶液每分钟释放出1pmol对硝基苯酚定义为一个酶活力单位 (U/ ml). 1.4pH的测定 采用pHS一25数字酸度计测定。 2 结果与讨论 2.1Bacillussp.StrainEB一87醋酶的基本性质研究 2.1.1Bacillussp.StrainEB一87酷酶作用最适pH试验 酶的最适pH各不相同，而且有时随着底物的不同而各异。为了了解Bacillussp.StrainEB-87 382 菌株酪酶的pH特性，采用pH二5.。一11.。内的Tris一HC1(0.05mmol/l)的缓冲液与酶液在40℃下振 荡反应lOmin,测酶活，绘制Bacillussp.StrainEB一87胞外醋酶受pH影响曲线图，见图to 飞 0 六 占 U 由图1司以看出，Bacillussp.StrainEB一87酷醉在pH 8 O 袄 口 ( 日 0 为7.2时，表现出最高酶活，pH在7.2一7.5之间相对酶活 白 . 4 n 力均在94%以上，但当pH超出该范围，很快失活:当pH 舍 . q 0 自 为6.5时，酶活损失36%;当pH为8.0时，酶活损失 O