肌原纤维调节因子-1(MR1)在心肌肥大中的作用的研究.pdfVIP

肌原纤维调节因子一l(MRI)在心肌肥大中的作用研究 王以光★一，刘秀华★_，李天伯’，王彦珍!，蔡莉蓉2，孙胜!，刘凤英： (1中国医学科学院中囝西和医科大学医药生物技术研究所北京100050： 2解放军总医院病理生理研究室北京100853；+通讯作者) 心肌肥大是指心肌细胞增大而无细胞分裂，是心肌细胞对高血压、心脏瓣膜病、心肌梗死及先天性心 脏病等临床常见疾病产生的适应性代偿，持续心肌肥大失代偿后可以出现心力衰竭和猝死，严重危及人类 生命。其发病机制尚未完全阐明，除了机械负荷和神经体液因子等刺激因素外，心肌收缩蛋白遗传突变是 心肌肥大发生的重要原因之一。最近，从人骨骼肌cDNA文库中筛选出一个新基因一肌纾形成调节因子一 1(MyofibrillogenesisRegulator-1，MR—1)，Western 表达。酵母双杂交实验研究表明它与肌肉收缩蛋白如肌球蛋白重链myomisin、肌球蛋白轻链肌球调控蛋白 化，将有助于从分子水平理解心肌收缩蛋白在心肌肥大发生中的作用。本工作首先在大鼠腹主动脉狭窄致 因沉默对于血管紧张素II(angiotensin 心力衰竭发病中的作用， 1材料与方法 1．1试捌及仪器： 克隆用宿主菌Ecoli pDMR．I为医药生物技术研究所构建。RNA干扰载体pSilencer 购自解放军总医院实验动物中心。 2000，RNA提取试剂Trizol 细胞转染使用脂质体Lipofectamine RT-PCR QuantitativeThermoScdptOne．Step 其它二抗和ECL检测试剂盒为Santa Amersham—Pharmacia公司。Alpha 生物工程材料研究所，其它试剂均为国产分析纯产品。电泳及转膜系统购自北京六一仪器厂，图象分析系 统是美国Midea Plus． Cybernetics公司lmage．Pro 1．2动物模型复制”J： 23ml／1009) 扎腹主动脉，其余同手术组。 SMUP-PC!型生物信号处理系统相连。以MFL 录颈动脉压和左心室内压。结束实验时，迅速开胸取心脏，称全心重和左室重，计算心脏系数(全心重与 制作切片，以苏木素_f尹红(H．E)染色，光学显微镜观察。 1．3免疫组化： 加相应二抗后以TAB显色。用图像处理系统扫描并将切片存储为计算机识别的图像文件，每张切片随机 选取30个点测定阳性颗粒的光密度值，进行半定量分析。 1．4乳鼠心肌细胞培养： 取出生24小时内的SD乳鼠，无菌状态下取心尖部组织．剪碎后经o 消化后制成细胞悬液，分装于聚苯乙烯培养瓶中，37℃静置90分钟，轻轻振摇倾出尚未贴壁的心肌细胞，， O．0 以含!O％小牛血清和5．溴脱氧核苷(BrdU 培养箱内进行原代培养。 3ll 1．5心肌期l胞瞬时基因转染： 原代心肌细胞培养至汇合度达到80％，提前2h用不含血清的DMEM培养液处理，随后采用脂质体 Lipofectamine 1．6细胞血管紧张素Ⅱ诱导方法： 培养至48h后进行检测。 J．7H3瑚嚏啉入细胞蛋白合成代谢涓定方法： 调整细胞浓度趸3x105，ml，接种于24 7L培养板上，每孔Iml。培养48h后换为无血清培养基，培养 24 H3_亮氨酸及各种处理因子，继续培养48 h后加入37kBq h。收集细胞于玻璃纤维素膜上，以三氯乙酸 测定放射强度。 1．8定量RT-PCR分析方法： RT-PCR 采用SuperScriptOne—Step 203．388 System进行RT-PCR。根据hMR-I基因eDNAbp位点序 5-CGATGGCCCAGGCCAGTCCCAC-Ac