内皮抑素融合蛋白的发酵和纯化研究.pdfVIP

高质量的抗体对于诊断试剂的研制不可或缺。从多克隆抗体到单克隆抗体，又 到基因工程抗体，其质量不断提高，应用范围不断扩大。但无论是多克隆抗体还是 单克隆抗体，都属于蛋白质类，研制周期长、特异性和灵敏度(亲和力)还有待改 of Evolution 进提高。 SELEX技术(Systematic by Ligands 制备提供了很好的工具。作为一种新的组合化学技术，SELEX应用大容量的随机寡 子特异结合的寡核苷酸配基；经过几轮或十几轮筛选，获得高亲和力、高特异性的 寡核苷酸配基，并通过对配基的化学修饰，增强稳定性。据测定，寡核苷酸配基结 合的解离常数可达pM～nM水平，能分辨同源蛋白或几乎完全一样的小分子复合 物，亲和力和特异性之其它任何类型的配基所不能比拟的，表明寡核苷酸作为诊断 试剂将比蛋白／多肽等具有更高的灵敏度和特异性，是免疫诊断学发展的方向之 一。另外，寡核苷酸配基(核酸型抗体)将有可能取代传统的抗体生产途径，不需 要免疫，可根据需要在体外合成和加以修饰。随着该领域研究的深入，有可能改变 多年来以蛋白质／多肽为基础的免疫诊断学模式。但是，自SELEX问世以来，主 要应用于拮抗剂的筛选，而在免疫诊断学方面的探索却刚刚起步，该技术在筛选抗 原模拟表位方面的应用迄今仍是空白。 内皮抑素融合蛋白的发酵与纯化研究 山东省医科院基础医学研究所(250062) 刘金生田志刚赵跃然孙油王郡甫张捷 Es)可以抑制肿瘤血管的形成，因此能抑制肿瘤 淑近年发现内皮抑素(endostatin 的生长和转移，具有良好的应用前景。我室利用大肠杆菌表达ES融合蛋白，并利用 分级沉淀和各种色谱分离技术对表达产物进行了分离纯化，为研究Es的生物学活性 提供必要条件。 材料与方法： 表达Es融合蛋白的工程菌株DH5Ⅸ，本室自行构建。 1、工程菌发酵：挑取单菌落转入20mlLB培养基内，培养过夜，将此菌液转入 4h。 2、收菌及破壁：收集发酵液，离心，弃上清，超声破碎细菌，离心留取上清。 3、硫酸铵分级沉淀：加入饱和硫酸铵溶液至饱和度为35％混匀，离心，留取 上清，再加入饱和硫酸铵至饱和度为65％，混匀，放置，离心，留取沉淀。沉淀以 溶液适量复溶。 ，速为2ml／min，280mm波长检测洗脱峰，集中目的峰溶液待下步纯化。 液B充分流洗平衡。将经凝胶过滤处理的样品上柱，上柱结束后以溶液B一溶液C 进行梯度洗脱。SDS电泳鉴定样品纯度。 6、样品活性测定：利用Es敏感细胞株，观察所得样品活性。 讨论： 实验表明，在合适的培养基中。扩增时间应适当，才能达到最好的表达，产率 最高，时间短，菌体数目少，IPTG诱导后单位体积内目的蛋白表达量低；扩增时 间太长，菌体数目可以很高，但IPTG诱导后，目的蛋白的含量却减少，经多次实 验我们确定菌体扩增时间为3一个小时，加入IPTG诱导4小时左右。 利用硫酸铵分级沉淀目的蛋白。可去除部分杂蛋白，减轻后续纯化步骤的压 力。在硫酸铵饱和度35％以下时有蛋白沉淀，经蛋白电泳检测多为杂蛋白。调节硫 酸铵饱和度至65％，此时蛋白沉淀大部分为目的蛋白。硫酸铵饱和度高于65％后， 沉淀物多为杂蛋白。 因为样品溶液含离子很多，所以在设计实验方法时，先经S-200HR凝胶过滤 层析，一方面可以使样品脱盐，使样品可以进行离子交换层析进一步纯化，同时依 照样品中蛋白分子量的差异，使目的蛋白与杂蛋白分离。 30S离子交换柱，经离子梯度洗脱后， 经分子筛层析后的样品，再上Source SDS电泳确定目的蛋白峰，蛋白纯度已较高，达95％以上。