HPLC-ESI-MS联用技术测定昆虫细胞表达人组织激肽释放酶地研究.pdfVIP

LC-127 HPLC．ESI．MS联用技术测定昆虫细胞 表达人组织激肽释放酶的研究 杨青梁振张维冰张玉奎 (中国科学院大连化学物理研究所国家色谱研究分析中心大连116011) 摘要 HPLC—ESI．MS在线联用的方法是一种灵敏度离、分辨率高的分离检测方法。本文建立 了利用HPLC．ESI．MS联用对蛋白质溶液进行定性检测的方法，并讨论了流动相对检测结果 的影响，利用该方法测定了昆虫细胞表达的人组织激肽释放酶，此方法灵敏度高，所用的分 析时间短。 关键词：HPLC-ESI．MS联用，人组织激肽释放酶 l 前言 kallikrein是一种丝氨酸蛋白酶，属于以丝氨酸残基为活性中心的丝蛋白酶家族下的一 时，且免疫分析方法中使用的抗人组织激肽释放酶196需自己制各，相当麻烦。质谱(嫩ss Spectrometry是一种近年来出现新型的分析检测技术，能够提供可靠的检测信息及高的检 测灵敏度，并且能够提供分析样品的结构信息和对分析样品进行快速定性、定量。特别是电 喷雾接口的出现，蛋白样品出现多电荷的质谱蜂，使得质谱在较小的扫描范围能够测定分子 量较大的蛋白质【2】。而通过分子量信息，有利于蛋白质定性及其结构特性的判断【3】。电喷 雾接口适合于HPLC．MS在线联用进行蛋白质的分离检测[4,5，6】。因此我们探索了用 HPLC—ESI-MS方法快速对样本中存在的微量Kallikrein进行测定。 2 实验部分 2．1仪器与试剂 试剂：甲酸、乙酸(分析纯)，乙腈(色谱纯)，MilliQ水。 样品：细胞色素C、胰岛素、牛血清白蛋白(上海生物化学研究所)，人组织激肽释放酶(自 制)仪器：高效液相色谱泵(日本Jasco公司)，AsahipakODP一50色谱柱(150×2．0mm 工作站及数据处理系统(美国Finnigan公司)。 2．2实验条件 液相色谱条件：流动相A：乙腈：水(95：5，v／v)+O．8％甲酸；流动相B：乙腈：水(5：95， 量：lOgL。 质谱条件：鞘气(50unit)，辅助气(10 unit)，喷雾电压(4．5kV)，加热毛细管温度(230C) 扫描方式：正离子扫描，扫描范围：400～2000。 3 结果与讨论 3．1流动相中酸性辅助溶剂的选择 一般来说，适合于电喷雾一质谱的酸性辅助溶剂有三氟乙酸、甲酸、乙酸；在本实验中， 选用甲酸作为流动相的辅助溶剂。 3．2流动相中甲酸浓度对质谱检测信号的影响 以细胞色素c和人组织激肽释放酶为例，观察了流动相中甲酸浓度对质谱检测信号强度的 影响。甲酸浓度在076—0．6％变化时，人组织激肽释放酶在质谱上的信号强度随着甲酸浓度的 增加而增大，甲酸浓度为0．6％左右为最大。细胞色素C随甲酸浓度的变化亦如此。 3．3蛋白质混合样品的分离检测 流动相经过优化选择，采用流动相A为乙腈：水(95：5，v／v)+O．8％甲酸，流动相B为乙腈： 水(5：95。v／v)+O．8％甲酸，洗脱条件为线性梯度。四种蛋白质混合样品的分离结果见图1。 由图i可见，四种蛋白质样品在18min内达到分离，并且利用质谱检测得到的分子量信息， 72 1_、_ 3、 4 、广＼。 图I四种蛋白质摁合样品的色谱分离 图2人组织激肽释放酶色谱分离 3．4HPLC—ESI-MS对昆虫细胞培养液中人组织激肽释放酶的检测 利用HPLC．ESI-MS联用对昆虫细胞培养液中的人组织激肽释放酶进行定性检测。它在 利用这5个多电荷质谱峰以选择性离子扫描模式对昆虫细胞培养液中的人组织激肽释放酶 进行定性检测，结果见图2，人组织激肽释放酶在17．92min出峰。 质定性定量方法相比简便，易于操作，所需试剂简单。每批表达培养后可以立即进行检测， 30min后即可获得结果。而使用传统的ELISA方法则需至少6小时才能获得结果。 参考文献 tHeath,A．B．Giordani，J．Chromatogr．638(1993)9 f11 Chem．57(1985)675 【2】C．M．Whitehouse，RN．Dreyer,M．Yamashita,J．B．Fenn，Anal 『313K．Biemann，Metho