免疫金银染色法对许旺细胞源神经营养因子进行标记地研究.pdfVIP

免疫金银染色法对许旺细胞源神经营养因子进行标记的研究 中山医科大学黄埔医院院办(510700)广州市黄埔东路183号 刘，J、林向剑平束家恺秦允 derivedneurotrophic 许旺细胞源神经营养因子(Schwann--cell 胞中提取的一种神经营养因子，相对分子质量为54000，对运动神经元有明显神经营养活性和促 进其损伤后轴突再生作用∞。SDNF作用机制不清楚，需要一种敏感性高且易行的方法对其进行 标记研究。免疫金银染色法(Immunogold--siver 胶体金来标记抗原，用银染液显色，具有较高敏感性和特异性，已成功应用于生物学和医学研究 领域[“。本实验探索用IGSS对SDNF进行研究的可行性。 一、材料和方法 1．主要试剂与仪器 SDNF单克隆抗体中山医科大学免疫教研室提供。5nm胶体金结合羊抗小鼠IgG抗体武 QWJ300TVBB5％二氧化碳培养箱。 2．许旺细胞分离，纯化与培养 性坐骨神经，剥去神经外膜，剪碎后用胰蛋白酶和胶原酶消化，200目不锈钢网过滤及离心后制 液一次。 3．许旺细胞单层细胞片制备和鉴定 上述细胞培养6～7d后，观察细胞长满培养瓶底，处于对数生长期。吸出培养液，加入 养液终止消化。吸出消化液并加入培养液，反复吹打制成细胞悬液。将细胞悬液移入4个已预先 鼠S一100蛋白作为对照。 4．免疫金银染色法对SDNF进行标记 取8片已用丙酮固定的单层许旺细胞片，4片作为实验组，2片为对照组l，z片为对照组2。 实验组置于0．05molTBS(PH7．4)中洗5rain，1：5小牛血清封cjj ·141· 对照组2组用0．05molTBS代替胶体合结合羊抗鼠IgG，其余试剂及方法与实验组一样。 二、结果 1．许旺细胞分离、纯化和培养 倒置显微镜下观察，双30rain差速粘附法纯化后的许旺细胞培养6—7d后，细胞密集成片， 几乎长满整个培养瓶底。细胞大部份呈双极突起，少数为多突起，细胞处于对效生长期。 2．单层许旺细胞片制备和鉴定 处于对数生长期的许旺细胞传入放有盖玻片的培养皿中，3--4d后，细胞几乎长满盖玻片。 ABE免疫组化鉴定，细胞对抗s一100蛋白呈阳性反应，阳性部位呈棕褐色。对细胞记数，纯净度 达95％。 3．免疫金银染色法对SDNF进行标记 光学显微镜下观察，实验组许旺细胞胞浆被染为代表银沉淀的黑色，细胞核被染为淡蓝色。 对照组只有细胞核被染为淡蓝色，胞浆没有黑染． 三、讨论 1．作为标记物的胶体金是一种金颗粒的悬浮液，它可吸附酶、血凝索、蛋白质和抗体等生物 高分子配体并保持其活性，它可渗入超薄切片的细胞内部结构加以标记。胶体金的红色在光学 显微镜视野中不易观察，但可作为银离子还原成银原予反应的催化剂。在加了含银离子的还原 剂后，在金颗粒周围形成显色的银沉淀，提高了灵敏度和可观察往。其原理是与被测标志或分析 物特异结台的肢体金，使银离子在其周围被还原成黑色沉淀，可用光学显微镜观察或测定灰度 加以定量，所以免疫金银色法较常用的荧光、酶、和铁蛋白等标记物具有更高灵敏度和更高分辨 率。一般来说，胶体金颗粒越小，其灵敏度越高，本实验即是采用5nm胶体金。 2．神经营养因子(Neurotrophlc 组化方法对其进行标记有一定的困难。本实验即是探索用免疫金银染色法对SDNF进行定位和 与单层雪旺细胞片进行结合，然后再用肢体金结合的羊抗小鼠IgG与之结合，最后用银染色剂 对其显色。发现雪旺细胞胞浆被染成黑色，而细胞核却无此现象。而在以往的实验中，尚未对SD- NF进行确切的标记。本实验首次对SDNF成功的进行了标记并可在光镜下观察，并由此证实了 胶体金及免疫金银染色法具有较高的灵敏度且简便易行，将其应用于对SDNF进行标记，具有 可行性。从而为进一步研究SDNF的体内分布、合成代谢、动态变化和转运开辟了一个新的途 径。 ·142·