基因转录产物在活体细胞中的成像的研究.pdfVIP

D．10 基因转录产物在活体细胞中的成像研究 李杜 李军 刘斌 黄杉生何晓晓 王柯敏+ (湖南大学生物技术研究院，湖南大学化学化工学院， 湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室，长沙，410082) 在单细胞水平上检测特定基因的转录产物是一项非常具有挑战性的工作川，目前常用的测定单 细胞内基因转录产物的方法是原位杂交检测法12】，检测对象是己固定的或经过预处理的细胞中的基 因转录产物。然而．基因转录产物在固定的细胞和活体细胞中的状态不同，固定化或预处理的过 程使我们不能真正了解RNA合成的过程以及其在细胞中的分布和运动。因此，直接观察活体细胞 中基因转录产物的运动尤为重要。跟踪和观察基因转录产物的一个有效途径是注射或转导在体外 合成的RNA荧光探针【目，这就要求探针与基因转录产物杂交后应有明显的荧光信号变化，否则需 要将未发生杂交反应的探针洗掉后才能进行观察。但这一步骤在活体检测中是很难实现的，所以 常规的荧光探针基本上都不适用于活体细胞中基因转录产物的检测【41。 基于分子信标(MB)的荧光传感技术为克服传统的基因转录产物检测的缺点提供了一个新的方 法。一方面，基因转录产物本身就是单链的，这样MB可以和存在互补序列的基因转录产物发生 杂交产生荧光增强信号：另一方面．MB在未发生杂交时由于存在荧光能量转移而不发荧光，这样 可以无须除去活体细胞中未杂交的分子信标，这一点对于活体检测是非常重要的。 为了在单细胞水平上观察／NGl转录产物在细胞中的表达和分布，我们利用能与1NGl转录 产物杂交的MB荧光探针，通过脂质体转导的方式将分子信标探针转移到活细胞(CNEl)中，再阚 激光共聚焦显微镜对活细胞中的杂交产1物进行荧光成像。结果表明，针对INGl转录产物设计的 MB探针能转入活体细胞中，在细胞核和一些细胞器的周围发出荧光显示INGl转录产物的存 在。在观察培养皿中多个CNEI细胞内的荧光信号时，发现不同的活细胞中，荧光强度是不相同 的；而对培养皿中一定区域的细胞来说，细胞是从一个细胞分化而来的，靠近中心区的细胞是衰 老的细胞，靠近边缘的细胞是新生的细胞。CNEl细胞在转导了MB以后，在细胞聚集区的中，D， 细胞内的荧光就强一些，在细胞聚集区的边缘部位，荧光就弱一些。因此可以得到结论，INGl的 转录产物在衰老的细胞中含量高些，在新生细胞中的含量少些。INGI基因就是一种细胞生长冈f， eduClrl ’通讯联系人．kmwang@mail．hunu ·174· 它来调控细胞的生长过程。文献中从多个细胞的统计结果指明[NGt基因在衰老细胞中的表达比新 生细胞中的表达要高耻10倍吲，我们的结果直接从单个细胞的水平上研究了这种表达量上的差异c 同时，用高灵敏电荷耦合器件对单细胞内MB的杂交反应进行成像，可以实现在单细胞水 平上对INGl转录产物进行定量研究。由成像结果可以看出，对于正常的细胞，荧光强度很高， 在800左右。高度分化的鼻咽癌细胞CNEl，其细胞质内的荧光值为175左右，而普通的鼻咽癌细 胞HNEl，细胞质中的荧光值很低，在78左右。这也说明了INGI在正常细胞中的含量远大丁在 肿瘤细胞的含量，为判断该基因的调控行为提供了直接的证据。 为了考察外界条件改变时基因转录产物的变化．将能表达INGl基因的质粒转入肿瘤细胞 进行培养后．再将MB转入肿瘤细胞，然后用激光共聚焦显微镜对其进行扫描。通过比较发现： 转导了质粒的肿瘤细胞比没转导质粒的肿瘤细胞内的荧光明显增强，其增强程度可用通过自绲 装的显微镜一荧光分光光度计联用系统将培养皿中的荧光强度定量化。 关键词： 基因转录产物成像 活细胞 X 参考文献 Chem，1999，71：522A-529A． [1】Yeung．E．D．Anal [2】2 andResearchChemicals，CRCPress，1994 HauglandR．P_，HandbookofFluorescentProbes R HJ．HistochemCell 1． WMolenaur [3】Dirks