用植物叶绿体为生物反应器表达重要外源蛋白研究.pdf

摘要 摘要 用植物为生物反应器生产外源重组蛋白已成为生物技术研究的新领域。在 植物中表达外源重组蛋白具有遗传操作简单、生产成本低、无动物病毒和细菌 毒素污染等优点。近几年发展起来的植物叶绿体转化技术可使外源基因定向导 入叶绿体基因组中并实现表达。叶绿体遗传转化与传统的核转化相比具有许多 优点，如高效表达外源基因；通过同源重组定点整合方式导入外源基因消除了 位置效应及基因沉默：能同时进行多基因表达；母系遗传方式可防止外源基因 通过花粉扩散等。因此，利用植物叶绿体为生物反应器生产动物口服疫苗、细 胞生长因子及工农业酶制剂成为生物工程领域研究的热点。衣藻 Chlamydomonasreinhardtii 是单细胞植物，素有“绿色酵母” greenyeast 之称，其含有一个单一约占整个细胞体积40％的大型杯状叶绿体，且与质膜紧 贴，使外源基因的转化和转化后的同质化过程较为容易。囚此，衣藻叶绿体是 表达外源蛋白质的理想材料。 necrosisfactor-related TRAIL turllor apoptosisinducingligand ，亦称Apo一2L， 是新发现的又一肿瘤坏死因子超家族成员，它能选择性诱导多种肿瘤细胞凋亡 而对正常细胞无毒性，这一特点显示TRAIL是一种新的抗肿瘤药物，在肿瘤治 疗中有着潜在的广泛应用前景．我们选择衣藻叶绿体基因组 p64TRAIL，通过基因枪将其导入衣藻叶绿体中，经壮观霉素抗性筛选，获得了 3个抗性衣藻转化子。转化子经过抗性继代筛选后，经PCR、Southernblot检测 blot检测分析表明sTRAIL编码区在衣藻叶绿体中获得了表达。Westernblot影 像摄录分析表明，表达的sTRAIL蛋白占衣藻细胞可溶性总蛋白的 O．43％-0．67％。实验结果证明用衣藻叶绿体为生物反应器生产医药蛋白是可行 的。 来源于Pyrococcus furiosus的耐高温Q．淀粉酶是一种重要的酒精工业用 酶，在植物中表达耐高温Q．淀粉酶可以大大降低用植物秸秆生产酒精的成本。 摘要 本实验室构建了来源于Pyrococcusfuriosus的耐高温a．淀粉酶基因的衣藻叶绿 体表达载体p64A。通过基因枪将其导入衣藻叶绿体中，经壮观霉素抗性 100mg／L 筛选，获得了9个抗性衣藻转化子。转化子经过抗性继代筛选后，经 叶绿体基因组中并得到表达。酶活性检测表明，转基因衣藻表达产物具有耐高 温d．淀粉酶活性，最高达77．5u／g鲜重衣藻。 用植物为生物反应器生产动物口服疫苗是一条安全、有效、廉价的动物疫 苗生产新途径。营养丰富，适口性好的豆科牧草是表达植物性动物食用疫苗的 and 首选受体植物，表达的疫苗无须提取纯化，可以直接食用免疫。口蹄疫 Foot 口蹄疫病毒表面主要保护性抗原基因VPl编码的囊膜糖蛋白可诱导机体产生中 和抗体，保护动物免受病毒侵袭。为了开辟生产口蹄疫疫苗的新途径，我们构 建了两种口蹄疫病毒主要保护性抗原基因VPl与强黏膜免疫佐剂霍乱毒素B亚 基 删的融合基因伽脚在优良豆科牧草百脉根叶绿体基因组中定点整合 表达载体。通过对百脉根叶绿体基因组的分析，选择合适的外源基因在其中的 整合位点，并设计引物用PCR方法扩增了两对叶绿体基因组同源片段筇柏、 叶绿体基因特异的强启动子Prm和终止子TpsbA为调控序列，构建了包含 CTBVPl融合基因表达盒和aadA壮观霉素抗性基因表达盒的百脉根叶绿体定点 整合载体pAKCV和pLBCV；经PCR和酶切验证，所构建的转化载体符合预 期设计。百脉根叶绿体转化载体的合理构建为百脉根叶绿体的转化及用叶绿体 生产动物可直接食用疫苗奠定了基础。叶绿体转化及后续工作目前正在进行之 中。 关键词： 衣藻 叶绿体转化TRAIL 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 II Abstract Abstract as has Theuseof bioreactorsforthe ofrecombinant plants expression proteins intonewfieldin research．Plant a developed biotechnology systemsprovidesimple animal lowriskofcontamination productioncosts，and by geneticmanipulation,low has virusesorbacterial transformation technology endotoxins．Recently,chloroplast the and been tointroduce into genome su