牛副流感病毒3型N基因的克隆与系统进化分析.pdfVIP

动物医学进展 ，2015，36(3)：32—34 ProgressinVeterinaryM edicine 牛副流感病毒 3型N基因的克隆与系统进化分析 薛 娟 ，曹 思，张 晓，冉旭华 ，闻晓波 (黑龙江八一农垦大学动物科技学院预防兽医学省重点实验室，黑龙江大庆 163319) 摘 要：扩增大庆地 区分离的牛副流感病毒 3型的N基 因，并进行 同源性分析 。设计特异性 引物，通过 聚合酶链反应扩增牛副流感 3型N基 因，将该基因分别连接到克隆栽体 的BamH I、Hindm酶切位点中， 测定插入片段的核苷酸序列，并利用分子生物学软件进行同源性分析 。序列分析结果表明，扩增获得BPIV一 3一N基 因全长 1548bp，编码 515个氨基酸，该 N段基 因核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与 GenBank中 日本分离株 910N基 因序列同源性较 高，核苷酸同源性为99．79，6，氨基酸同源性为 100 。 关键词 ：牛副流感病毒 3型；N基 因；序列分析 中图分类号 ：$852．659．5；$858．23 文献标识码 ：A 文章编号 ：1007—5038(2015)03—0032—03 牛副流感病毒 3型(Bovineparainfluenzavirus 保存备用 。 type3，BPIV一3)属于副黏病毒科副黏病毒属成员 ， 1．1．2 酶 和 试 剂 pfuDNA Polymerase，M— 为单股负链有囊膜的RNA病毒_l1]，我 国于 2010年 MuLV ReverseTranscriptase，Fermentas公 司产 成功分离得到该病毒 。BPIV一3在临床上是牛呼吸 品 ；Wizard@SV GelandPCR Clean—Up System 道疾病综合征 (Bovinerespiratorydiseasecomplex， A9280试剂盒、DNAMarkerDL2000、6×Loading BRDC)的主要病原[2]，而牛呼吸道疾病综合征是引 buffer、dNTP(2．5mmol／L)、BamH 工、HindⅢ、 起世界范围内的舍饲牛发病和死亡的主要 原因_3]， pMD~18一T Vector，TaKaRa公 司产 品 ；Trizol，In— 多 国均有该病发生的报道 4【]。牛副流感病毒 3型属 vitrogen公司产品；质粒小提试剂盒 ，Tiangen公司 于呼吸道病毒 ]，同属 的成员还有人副流感病毒 3 产 品；其他试剂均为国产分析纯。 型、人副流感病毒 1型和仙台病毒。BPIV～3是一类 1．2 方法 重要的人畜共患病毒 ，与人副流感病毒 3型 的结构 1．2．1 引物的设计与合成 参考 GenBank上收录 蛋 白HN、F、N、P、C和M蛋 白的氨基酸序列高度相 的BPIV一3基 因全序列 (GenBank：AB770484．1)， 似 ]。其中N蛋白相似度高达 86 ，这预示着该基 设计特异性引物 ，委托北京六合华大基 因科技股份 因保守性可能较高。 有 限公司合成 。BPIV一3-N—Up：GCCGAAAGGT— 本试验针对 BPIV一3一N 基 因进 行研 究。根据 GAGGGGAAAGAAATC ；BPIV一3一N—Low ： ACT— GenBank上已知参考序列设计一对特异性引物 ，采 TGTTGCTGATGATGGTGATC。 用 RT—PCR方法扩增从大庆地 区某 牛场患有呼吸 1．2．2 RNA 的提取及 RT—PCR扩增 取病毒液 ， 道疾病 的病牛体 内分离得到的 BPIV一3N基 因，并 参照 TRIzol使用说 明书进 行 RNA 提取，取样 品 用分子生物学软件对其核苷酸序列和氨基酸序列进 RNA进行反转录，反转录体系如下 ：RNA 3 “L，引 行同源性分析 ，为研究该病毒 的地理分布及分子流 物 1 L，混匀 ，7O℃ 5min，冰浴 2min；加入 5×Re— 行病学特点提供参考。 action