颗粒性甲烷单加氧酶地研究.pdfVIP

I．光催化、电催化和生物催化 1305 颗粒性甲烷单加氧酶的研究” 崔俊儒 辛嘉英 胡霄雪刘婷婷李树本夏春谷 (中国科学院兰州化学物理研究所羰基合成与选择氧化国家重点实验室，兰州730000) 甲烷单加氧酶(MMO)在细胞中有两种不同表现形式：可溶性甲烷单加氧酶(sMMO)和颗粒性 研究较多，而对pMMO催化性能和作用机理认识不足。pMMO反应机理研究的最大势垒是其纯化过 程，近年来对pMMO的催化活性中心及其性质的研究主要在膜水平上进行。本文利用在高铜( 生成和活性都没有影响，而在分离纯化过程中对其稳定性有明显影响。TEM照片分析显示：Cu”浓 响。对苯二酚可作为pMMO最直接的电子供体，为进一步在酶水平对pMMO的催化活性中心及其 性质研究打下了基础。 本文采用的IMV3011菌株由俄罗斯科学院催化研究所赠送，该所曾将其用于丙烯环氧化研究。 我们发现该菌株在无铜条件下进行培养时，经超声波破碎后细胞碎片活性损失严重，而再经离心后上 清基本测不到活性；菌株在有铜条件下进行培养时，超声波破碎离心后上清可以测到大于lo％活性。 这说明在pMMO的分离纯化过程中，Cu2+具有十分关键的作用。图1所示，超声波解离下来的膜蛋 CI。一6B离子交换层析柱分离后，主要被分成了4个组分。组分I是不与柱填料 白经DEAE—Sepharose 吸附的带正电荷的杂蛋白，组分Ⅳ是与柱填料吸附较强的带负电荷的杂蛋白。分别向组分I和组分Ⅲ 中添加外源电子给体发现，Cu”、对苯二酚存在下的组分I具有较高的MMO活性，而组分I具有利 用NADH还原苯醌为对苯二酚的能力。因此断定倒分I是pMMO组分，而组分Ⅲ是催化电子由 定，发现在分子量为～90000处有一蛋白峰。培养基中铜的有无对MM0的分子量几乎没有影响。 少的金属蛋白，组分I则是一种Fe多Cu少的金属蛋白。 抑制pMMO的活性，其中对纯化的pMMO活 性抑制最为明显。Cu”对pMMO的激活作用 m OL o oL 可能与Cu2+参与了pMMO活性中心调控或 电子传递过程有关，因此有关pMMO的活性 《0 中心研究应在Cu2+参与下进行。 0 ， ， mIIII】4 m●●●●●●●小 0 当有pMMO可利用的电子供体存在时，O 一 一 pMMO催化的丙烯环氧化反应可连续进行， j』 瓦L^a日目^R日”畦飞 ～b 一＼～ 一， 表现出较高的环氧化活性。细胞经超声波破 娶一＼m～c J／o n¨、I一兰：． 碎、冷冻超速离心后上清液中分别加入不同的 a of on Fig．1ChromatographypMMO 外源因子，结果如表2所示。 CL—6Bcolumn DEAE--Sepharose *国家自然科学基金重点项B，国家重点基础研究发展规划项目(G1999022406) 可持续发展战麟中的催化辩学与技术 Table1 Ef淞lofEDTAandCu2+OH