GroE辅助蛋白质折叠地研究.pdfVIP

GroE辅勤蛋白质折叠的研究‘ 杨晖董晓燕白妹张颖张立孙彦 (天津大学生物化工系．天津·300072) 关t词。OroEⅥS折叠复性溶菌酶 引言 近年来，大量的研究襄明。不论是体内新生肽的正确折叠。还是体外伸展肽链的复性， cIlapemn鼯少-41· 都普遍涉及到一类蛋白质的作用，这类蛋白质通称分子陪伴(molecular 分子陪伴属于热休克蛋白．广泛分布于原核生物和真核生物中嘲，热休克、细菌感染等都 能引起这类蛋白在体内的增加。分子陪伴的作用是防止其它肽链的错误折叠，而自身并不 成为其最后天然结构的一部分。目前，对源于大肠杆菌的GmE蛋白的研究较多，也较全 双层饼状，每个亚基分子量为57KD．GroES也是～寡聚体，由7个亚基组成的单层环状， 远高于无分子陪伴下的自发复性率．此外。在有分子陪伴存在的情况．复性速度可显著提 高，是自发复性的6倍以上．因此，本研究分别采用游离和固定化的GmEL／ES蛋白在体 外对盐酸胍变性的溶菌酶进行了复性研究。 1．材料和方法 1．1菌种及试剂 Health Horowitz博士(Univ．Texas GroE高表达质粒pND5大肠杆菌由P Sci．Center) 置美国SIGMA公司，甲酰基-纤维索介质购自日本．其它化学试剂均为分析纯。 1．2十二烷基硫酸钠．聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS．PAGE)和蛋白质浓度测定 1．3菌的培养与诱导表达 工程菌在含有100 生长期后以l：lO的比例转接至新鲜培养基中培养至对数期，迅速升温至42C进行热诱导。 在不同热诱导时间离心收集菌体，进行SDS分析． ’国家自然科学基金资助项目【No 一1184— 1．4GroEL／ES的分离纯化 将热诱导7小时菌液于9400r／rain离心10rain，收集菌体，以lO倍湿菌体的体积加 EDTA，50mmol／dm3KCl)， 入破碎缓冲液(50mmol／dm3Tris-HCL，pH8．0，5％甘油，Immol／dm3 超声破碎。再于16000r／min4℃离心20min,除去细胞碎片，收集上清(含目标蛋白GroE)． A(50mmol／dm3Tris．HCL．pH7．6，5％甘油，Immol／dm3EDTA，100mmol／dm3KO)平衡12h。上 KCl至 样完毕后。先用缓冲滚A洗去部分杂蛋白，后用梯度洗脱(从100mmol／dm3 500retool／dins 包埋浓缩．．20℃冻存备用。 1．5溶菌酶的活性检测18l 40 却后测420rim处吸光度值，以420rim吸光度值的降低计算酶的活力。 1．6 GroEL，ES的固定化 选用甲酰基．纤维素微球作为固定化介质，按照用户手册所述的固定化方法，以一定 和GruEL时，加入了10mmol／dm3ATP镁盐。 1．7溶菌酶的变性与复性 用6mol／dm3盐酸胍于40℃使溶菌酶变性后，迅速将失活溶菌酶溶液42ul与含有 或固定化GroEL／ES、GroEL、BSA的复性缓冲液(50mmol／dm3 u Mgcl2，20mmol／dm3KCI，)混合，最后整个复性体系体积为5ml，酶的最终浓度为0．2 mol／dm3，在37C下复性。 2．结果与讨论 2．1菌体的诱导和表达 为了获得GmEL／ES的高表达量，我们考察了 Gro