毛细管电泳-激光诱导多光子荧光检测探究.pdfVIP

毛细管电泳一激光诱导多光子荧光检测研究 刘笔锋*陈胜 骆清铭 华中科技大学生物医学光子学教育部重点实验室，武汉，430074, 毛细管电泳经历20年的发展，技术上已逐步成熟。在生命科学、环境和药物等领域获得 了广泛应用。将阵列毛细管电泳用于大规模基因组测序即是其中成功的范例之一。在检讨毛 细管电泳成功时，首先不容忽视的因素是高效分离模式的多元化 (包括毛细管区带电泳、胶 束电动色谱、毛细管凝胶电泳和毛细管等电聚焦等);而另一个决定性因素，无疑是检测技术 的不断创新 (如紫外/可见、激光诱导荧光、电化学和化学发光检测器等)，尤其是激光诱导荧 光检测的发展，将检测灵敏度推进到梦寐以求的极限一单分子水平。于是，高效分离技术与 高灵敏度检测器的联用，即毛细管电泳一激光诱导荧光检测，成为绝对主流的组合。与此同 时，各种荧光光谱技术的引人，如荧光偏振、多光子激发荧光、荧光相关谱、荧光寿命和全 内反射等，极大地丰富了激光诱导荧光检测技术的发展。 Shear研究组首次将多光子激发荧光检测技术引人毛细管电泳[1l，他们采用钦蓝宝石飞秒激 光器，在毛细管区带电泳[[2l和胶束电动色谱[[31中，实现了柱后双光子激发荧光检测。采用基于 飞秒脉冲激光技术的多光子激发荧光的优点在于:1、非常低的检测背景和几级的检测体积， 因此，很容易实现zmole-ymole水平的检测限1[21;2、容易实现超快反应过程检测4[1;3、超宽谱 带激发，对350-600nm内任意谱线激发的分子，可以实现同时激发，因此可以避免复杂样品 对多激光谱线的要求。然而，飞秒脉冲激光器过于昂贵的费用使其在毛细管电泳领域很难获 得广泛应用。 本文研究的重点集中在发展基于连续光激发的多光子荧光技术，用于毛细管电泳检测。采 用钦蓝宝石激光器和廉价的半导体红外激光器，在连续光状态下实现了小分子荧光染料、荧 光蛋白和量子点等三种常用的标记物的电泳分离与双光子激发荧光检测。 比较了柱上与柱后检测的差异，发现柱后检测的灵敏度显著高于柱上检测，其原因在于柱 上检测时，毛细管柱强烈的光散射作用，极大地降低了聚焦点光能量。采用钦蓝宝石激光器， 分别在飞秒锁模和连续光两种输出状态下，通过验证激光输出功率和荧光强度的关系，证实 了获得的信号是双光子激发荧光和采 用连续光实现多光子激发荧光地可行 n 3 性。在钦蓝宝石激光器连续光输出状 叻 态下，成功地实现了小分子荧光染料 钾 RhodamineB和Sulforhodamine的毛细 尼 叨 管区带电泳分离和多光子荧光检测， 。 趋 卜 艺 喘 曰 线性范围超过2个数量级，浓度检测 限为8x10-7M，质量检测限约为8x 州 10-22mole。进而，分析了转染有重组 叨 荧光蛋白dsRed的细菌E.coli。考虑到 D 2 2 5口二 1000 150口 2.艾1 25 以〕 30口〕 35M 钦蓝宝石激光器的昂贵费用，采 Datapoint 用廉价的半导体红外激光器，同样实 Fig.l Electropherorgam of two dyes by capillary 现了小分子荧光染料RhodamineB和 electrophoresiswithcontinueswavebasedmulti-photon excitation fluorescence detection.1,RhodamineB;2, SulfoRhodamine的毛细管区带电泳分 Sulforhodamine.Sampleconcentration:1.0x105M.Buffer:10 离和多光子荧光检测 (如图1)，并进 mMborate(pH9.0).Sampling:10sat10cm.Voltage:16kV 一步实现了两种脂溶性纳米荧光颗粒 *通讯联系人:刘笔锋 教授 博士生导师 777 一量子点的分离与