RNA干扰-基因功能反向遗传学的研究的工具.pdfVIP

第五届全国环境与职业医学研究生学术研讨会(论文集) RNA干扰一基因功能反向遗传学研究的工具 王勇朋，邹焰 摘要：随着1998年RNA干扰(RNAinterference，RNAi)现象在秀丽隐杆线虫中发现 以来，RNAi作为一项在分子生物学及细胞生物学研究的新技术得到了快速发展。伴随着人 类基因组计划(human genomeprojectjlGP)的基本完成，以及一系列组学概念的提出，作 为反向遗传学研究的工具—．RNAi在基因功能研究、基因治疗、以及基因工程等方面发挥着 巨大的作用并存在着巨大的优势。该文就近几年来RNAi的机制、基因功能研究和基因治疗 方面的研究进展综述如下。 关键词： RNA干扰反向遗传学 基因功能 RNAi领域的研究不是源于回答一个特殊生物问题的期望，相反，RNAi研 Mello和Andrew 究源自Craig Fire的实验观察，即在线虫中双链RNA(double． stranded 进展及广泛应用，RNAi作为一种高通量的基因研究方法已经成为了反向遗传学 研究重要的工具。而且它在药物效能检测、基因治疗及转基因食品等方面也有巨 大的应用价值。随着人类基因组计划的初步完成，后基因组计划的提出与实施， 以及功能基因组学、环境基因组学、毒理基因组学概念的提出，将使RNAi存在 巨大的发展空间。 删的机制 小发卡样RNA(small 和一种核糖核蛋白质结合，形成RNA诱导沉默复合物(RNA．induced silencing． 作者单位；遵义医学院预防医学教研室，遵义，563003 第五届全国环境与职业医学研究生学术研讨会(论文集) 解为单链，这些反义siRNA与同源mRNA特异结合，并引导RISC专一地与靶 或者被核酸外切酶降解，或者在依赖性多聚酶的作用下又形成新的siRNA，再次 被识别并切割形成新的RISC，从而使基因表达沉默，蛋白质表达受到抑制，形 成逐级放大模式，在生物体内产生巨大的沉默效应【21。 RNAi在反向遗传学研究的应用 基因功能的研究 在人类基因组测序工作基本结束之后，下一步的重要工作是研究每一个基因 的功能。历史上看，基因功能的研究主要靠经典的正向遗传学，即先用一种诱变 剂(如甲基磺酸乙酯)处理后，分离出突变型，随后通过定位克隆分离突变基因， 并揭示其功能。例如遗传病基因的克隆。对于了解基因功能来说，这是一个相对 缓慢的过程。而反向遗传学的原理正好相反，人们首先是改变某个特定的基因或 蛋白质，然后再去寻找有关的表型变化。例如基因敲除技术或转基因研究。简单 地说，正向遗传学是从表型变化研究基因变化，反向遗传学则是从基因变化研究 表型变化。以RNAi为基础的反向遗传学基因功能研究越来越显示出其强大的优 势。 以RNAi为基础的筛选是增进了解基因功能的一种快速方法。RNAi容易用 于大规模、高通量的系统研究。这一点已经在线虫中得到证明，在植物体系及哺 乳动物细胞研究中也不断在这方面取得进展。RNAi筛选有以下优点： 1．能以惊人的速度确定基因序列与功能之间的关系。尽管经典遗传学筛选 能够快速鉴定突变动物，但突变基因的定位克隆仍很费时——从突变表型到受影 响基因可能需要几个月时间或更长。随着人类染色体测序的完成和后基因组计划 的实施，因而用RNAi观察到的任何功能缺失表型都自然地与预测的基因功能发 生联系。 2．在RNAi筛选中，每个基因被靶向作用一次而且仅此一次，这使其对一 个特定途径和过程的所有分子成分的鉴定比经典正向遗传学筛选要更全面。 3．在RNAi影响的群体中通常可看到一系列不同程度的基因抑制，即从弱 到强的基因功能缺失表型。这就使得在经典正向遗传学筛选中不能鉴定出的带有 致死性无效表型的相关基因，可以用RNAi方法筛选鉴定出来。 33l 第五届全国环境与职业医学研究生学术研讨会(论文集) 4．RNAi能靶向合子和母源信息(maternal