骨髓细胞低温保存20年后细胞活力探讨.pdfVIP

缀≥ 2009 ※第六届全国低温生物医学及器械学术大会※ 山东·青岛 飞芝：：∥ 幸论著+ 骨髓细胞低温保存20年后细胞活力探讨 黄友章，沈建良，宫立众，尹文杰，刘毅，岑坚，郑培浩，赵德峰 海军总医院血液科，北京， 100048 【摘要】 目的用不同保护剂、降温方法降温，并液氮中保存入骨髓细胞，观察20年后细胞相关存活指标，揭示细胞 基淀粉．4％人血白蛋白 为保护剂，采用自控程序降温仪或超低温冰箱降温的低速降温，液氮液相中保存20年后，400 复温，检测细胞相关存活指标。结果骨髓细胞保存20年后干细胞回收率良好，体现在粒单系造祖血细胞 CFO．GM 、 冰箱降温液氮中保存是骨髓干细胞长期保存的方便、可靠方法。 【关键词】 骨髓；低温保护剂；低温保存；造血干，祖血细胞；间充质干细胞 因不同种类细胞的其结构和特性不一，采用 2深低温保护液的配制 的低温保护剂和降温方法也不一。虽然骨髓细胞 一种是DMSO．AuP保护剂：DMSO 美国， 内细胞成分复杂，但保存的目的是造血细胞移植， 重点则是千细胞。干细胞有造血干／祖细胞和间充 培养液内至lL，置4。C冰箱30min后待用。另一 质干细胞等，又因为干细胞是有细胞核的单个核 种是DMSO．HES．HuA保护剂：DMSO0．1L、12％ 细胞，对单个核的细胞的低温保存普遍采用的方 羟乙基淀粉磷酸盐缓冲液 HES，W／V，MW≥200 法是以二甲基亚砜 DMSO 为保护剂，慢速率降温万，日本，极东制药工业株式会社 0．5L、25％人 至一80℃，直接投入液氮保存。理论上讲，一79℃时 酶的生物活性近乎停止，．196℃时细胞的新陈代 至1L，置4C冰箱30min后待用，临用前配制。 谢则基本停止，细胞可以长期保存u_1。骨髓细 在4。C条件下向骨髓细胞内缓慢滴加等体积 胞内加入lO％二甲基亚砜一lO％自体血浆或5％二 甲基亚砜．6％羟乙基淀粉．4％人血白蛋白的保护 剂，用自控程序降温仪或超低温冰箱降温低速降 X 温液氮液相保存20年后相关活力如何?本研究做 4％，骨髓有核细胞终含量5～10109／L，分装2ml／ 了如下分析观察。 管 丹麦，Nune 中，4。C下30min。 材料与方法 3骨髓细胞冻存与复温 1 自控程序降温与保存：将以上制备好 l骨髓细胞样本的采集与制备 的骨髓样本置自控程序降温机 美国， 在局麻下采集骨髓细胞 拟采取自体移植患 者 600．800ml，4C下，自然沉降60min，4009离℃降至．30c 为减少释放热对细胞损伤，当细胞标 心rain除去细胞液中血浆，用RPMll640培养液本温度降至4℃时，给以10℃／min超速降温 ，再 美国，GIBCO 制备骨髓细胞悬液，常规细胞计以10℃／min降至．800C 全过程降温仪自动记录标 X109／L。 数，有核细胞含量10～20 本降温曲线 ，置液氮液相中保存2l一25年 中位数 一60一 2009 ※第六届全国低温生物医学及器械学术大会※ 山东·青岛 鳓 渤’ 际降温率。 2 低温冰箱降温与保存：连同保温盒 自 温后1L体积内总有核细胞形成的CFU．GM集落 制，厚度lena 的骨麓样本置_80℃低温冰箱中 数／冻前lL体积内总有核细胞形成的CFU．GM集 24h 并在．80。C低温冰箱中配入降温仪上的温度探 测仪以记录样本降温曲线 ，取出样本置液氮液相 落数×100％。 中保存21．25年 中位数22．0年 。测定细胞从412另一种是LTC．IC：取无血液病骨髓细胞制备 至液氮液相 ．196C 的实际降温率。 x 加入20％FCS、5 保存期间液氮储器仅在添加液氮 以保证标 10√mol／L氢化考的松，l× 本浸泡于液氮液态中 与放入或取出标本时开放。 检测时，从液氮液相中取出骨髓细胞小管标本， ℃，5％C02孵箱内培养，每周半量换液1次，将 投入40℃水浴中，待融化后，立即用含10％胎牛14d孔底形成良好的基质细胞层，X线15GY照射 去除上清液，加入2×105待测细胞、20％FCS的 血清 FCS 的RPMll640培养液液缓慢稀释至 10ml左右，洗涤3次，制备骨髓单核细胞悬液 BMMNC 为待测细胞。 培养，每周半量换液一次，于第4周移去孔内上 清，用胰酶消化，加入20％FCS的IMDM培养 4对照骨髓细胞样本的采集制备 液，充分混匀，不再细胞计数，进行琼脂半固体 有两种，一种是粒单系造血祖细胞 cFu—GrV0 和长期培养起始细胞 LTC．ic 培养的对照：在骨 髓细胞未加或加低温保护剂后计细胞体积和细胞 养14d后计数集落为LTC．IC。 数，再洗涤后进行CFU—GM和LTC．IC培养，以 未加保护剂为对照，以加入保护剂后的骨髓细胞 1L体积内总有核细胞形成的