建立PCR检测奶粉中坂崎肠杆菌的方法.pdfVIP

2007中国中部地区农产品加工产学研研讨会论文集——畜禽加工 建立PCR检测奶粉中坂崎肠杆菌的方法 ．’一王羽1，侯俊如1，马波1，王卫红2，许新军2，李英军1，张伟1 摘要：食品安全突发事件频率高是近年来食品安全问题的一个显著特点，坂崎肠杆菌是自1961年发现以来 一直受全世界的关注的一种食源性致病菌，能在婴幼儿中引起脓血症、脑膜炎或坏死性小肠结肠炎特别是对 新生儿或免疫力较低的婴儿，常会导致严重的后遗症甚至死亡。该文建立了PCR检测奶粉中坂崎肠杆菌的方 法，并与其他几种方法进行了比较研究。 关键词：PCR；奶粉；检测；坂崎肠杆菌 本试验采用了23SrDNA的一段保守序列作为目 l研究意义和研究内容 的片断，设计出特异性较强的一对引物，扩增产物克 1．1研究意义 食品安全问题一直是人们关注的焦点，坂崎肠杆 核苷酸序列库(www．ncbi．nlm．nih．gov／)。 菌作为一种条件致病菌成为一个新的健康问题和公 本课题主要研究内容包括以下几个方面： 众关注焦点，坂崎肠杆菌的来源和污染途径尚不为人 (I)PCR反应单因素分析，检测引物的特异性。 类所知，但种种证据表明新生儿的感染与其食用的奶 (2)检测人工污染的奶粉，确定最低检出限。 粉的污染有关。Urmenyi和Franklin于1961年首次 (3)将确定的PCR程序用于对实际样品进行检 报道了由该菌引起的两例脑膜炎事件，随后在全球范 测，确定该方法的特异性、灵敏度、符合率。 围内相继出现了由坂崎肠杆菌引起的脑膜炎、败血症 2材料与方法 和坏死性小肠结肠炎的报道。2002年，国际食品微 生物标准化委员会(ICMSF)把坂崎肠杆菌列为“严2．1实验材料 重危害特定人群，危害生命或慢性实质性后遗症或长 2．1．1菌种 期影响”的一种致病菌。从大多数病例看，坂崎肠杆 表1试验用菌株 菌其主要危害对象是身体状况较差的婴儿，虽然有抗 生素的治疗，但总体死亡率在有些病例中却高达80％ 以上。 当前国外使用的坂崎肠杆菌检测方法仍是常规 培养法，由于其检测周期长(5~7d)、程序复杂、所 需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。 FAO／WHO在2004年【9J召开了两次国际相关会议， 倡导采用国际通用的分子生物学方法来检测坂崎肠 杆菌，以弥补传统方法的局限性。随着分子技术的日 益发展，PCR技术用于食品检测领域也日趋成熟。 1．2研究内容 收稿日期：2007-06-03 作者简介：王羽(1982．)，女，在读研究生，研究方向为食品 安全。 2．1．2主要培养基 126 2007中国中部地区农产品加工产学研研讨会论文集——畜禽加工 脑心浸液肉汤、营养肉汤、肠道菌增菌肉汤、营 由上海生物工程技术公司合成。 养琼脂、结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂、胰蛋白酶大 3实验方法 豆琼脂、0．1％蛋白胨生理盐水。 2．1．3仪器与设备 3．1PCR检测方法的确立 WhatmanTGradient (1)坂崎肠杆菌纯菌体的DNA提取 PCR仪，DXY-33A型电泳 仪，Uvitee，BTS．20．M型凝胶成像系统，超净工作 台，去离子水机，高速离心机，手提式高压灭菌锅。 肠杆菌接入脑心浸液培养基中，培养18～24h，然后 2．1．4样品和生化试剂