猪肌肉组织双向电泳分离条件的建立与优化.pdfVIP

第十五次全国动物遗传育种学术讨论会论文集 猪肌肉组织双向电泳分离条件的建立及优化 徐永杰1，熊远著p，金美林2 1·农业部猪遗传育种重点开放实验室农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，华中农业大学；2’农业微生物国家重点 实验室动物传染病分室，华中农业大学，武汉430070 关键词：猪；肌肉组织；双向电泳；MALDI．TOF．MS 引言 肌肉组织中蛋白质的含量在20％以上，而蛋白质是行使功能的主体，在不同状况下一些蛋白的表达会发 生相应变化，蛋白质组学技术能够在特定时刻直观地展现这些种类繁多、反应迅速的蛋白质表达，这种高通 量蛋白质分析技术可以提供参与决定肉品质的各种生理过程中的蛋白质结构和功能等方面的更多信息，为猪 肉品质研究开辟了一条新途径。双向电泳技术是蛋白质组学的核心之一，因此，建立猪肌肉组织双向电泳的 分离条件对开展猪肌肉蛋白质组学研究格外重要。 材料方法 猪屠宰后去背最长肌，速冻液氮中，而后．80℃保存。蛋白质的提取采用两种方法，其一用裂解液7M尿素、 DNaseI、 2M硫脲、4％(w／v)CHAPS、2％IPG3—10、I％DTT、l％蛋白酶抑制剂、200ug／ml BufferpH Buffer(10mM mM A)提取肌肉组织总蛋白；其二，分布提取，第一步利用TES 7．6，I 50ug／mlRNase Tris，pH M DNase EDTA，and0．25 sucrose、1％蛋白酶抑制剂、200ug／lTll (主要包括肌浆和线粒体的各种酶)，第二步利用裂解液提取剩下的蛋白。蛋白样品经双向电泳分离后采用银 Master2D 染得方法染色，得到的图谱用Image 结果与讨论 SE600和Ettan 基于EttanTM DALTsix二向垂直电泳仪初步建立肌肉组织 IPGphorTM等电聚焦系统、Hoefer 的2．D分离条件，结果显示，肌肉总蛋白中碱性蛋白较多，但18厘米pH4．7的胶条分离效果优于pH3—10线 采用两步法对肌肉总蛋白进行提取，第一步提取的蛋白中较好的除去了肌肉总蛋白中的丰度很高的结构蛋白 (肌动蛋白、肌凝蛋白、微管蛋白等)，同时也富集了一些低丰度蛋白，提高了低丰度蛋白在2．D图谱中出现 的几率，两步提取的蛋白之和也远多于一步提取的总蛋白。而第一步提取的水溶性蛋白多为代谢酶类，并富 集了一些低丰度蛋白，这对用蛋白质组学方法研究在活体及屠宰后早期都存在较旺盛的代谢活动的猪肌肉组 织从而揭示猪肌肉品质形成的分子机制具有重要意义。 致谢 本研究受‘973”项目(2006CB 102102)资助。 一252—