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2010年微纳尺度分离和分析技术学术会议暨第六届全国微全分析学术会议 液滴阵列芯片滚环扩增检测microRNA 1 2 1 1 1 1 2 1 林彩琴 ，李娟 ，张云霞 ，俞泽奇 ，祝莹 ，姚波* ，席建忠* ，方群 1. 浙江大学化学系 微分析系统研究所，杭州，310058 2. 北京大学工学院 生物医学工程系， 北京，100871 MicroRNA(也称miRNA)是一类长度为18-25nt 的单链小分子非编码RNA ，其主要作用 是以mRNA 为靶向目标，通过对mRNA 进行切割或抑制翻译过程，在动植物体内起到重要 的调控作用[1]。大量研究发现 microRNA 在包括胚胎发育、细胞凋亡、免疫及肿瘤发生、 病毒感染等多种生理和病理过程中发挥重要的作用。实时定量PCR 是研究基因表达分析的 主要工具，同时也是研究包括microRNA ，其他小非编码RNA ，mRNA 和DNA 表达水平最 为常用的生物技术之一。但是，microRNA 分子长度很短，用传统的 PCR 技术难以对其进 行扩增，因此，研究人员提出了一些改良的 PCR 技术[2,3]。此外，一种在等温条件下进行 的滚环扩增技术也被提出，并用于microRNA 定量分析[4-6]。 滚环核酸扩增(Rolling circle amplification, RCA)技术是基于自然界中环状DNA 分子滚 环式的扩增机制而发展起来的一种核酸扩增技术。噬菌体Ф29 DNA 聚合酶具有很高的链置 换活性且错配率较低，可以通过一条与环状DNA 模板配对的引物分子，不断沿着环状模板 合成重复序列的线状DNA 分子，从而实现等温条件下的扩增, 不需要传统PCR 的热循环仪。 RCA 还可通过使用两条引物得到一系列模板分子整数倍的双链 DNA 产物，称为 RAM(Ramification amplification) ，可以实现指数扩增，与RCA 相比具有快速、灵敏、特异 等特点。 RAM 或RCA 技术可以在等温条件下对核酸分子进行扩增，不需要热循环装置，因此， 比传统PCR 技术更加有利于系统的微型化和便携化，尤其与微流控芯片系统相结合，将具 有更广阔的应用空间。微流控芯片能够提供一个远小于传统反应体系的微反应器，同时能够 实现更高的样品通量，但是目前微流控芯片上不同样品多元多步反应还比较难于实现，或需 要比较复杂的芯片设计和装置结构[7]。基于上述原因，我们设计了一套开放体系的纳升级 液滴阵列芯片，采用标准光刻和化学改性技术在硅片上加工出6 ×6 纳升级液滴阵列，通过 普通移液器或自动移液装置可以将样品和试剂相继加入，进行多步反应。为了实现芯片上的 等温扩增反应和实时定量荧光检测，我们设计了一套以 ITO 玻璃为加热元件的恒温控制系 统，温度范围在30°C-90°C 之间，满足RAM 及一般酶反应的温度范围。此外，我们以大功 率blue LED 作为激发光源，CCD 进行成像，每60s 进行一次数据采集，自行编写软件进行 数据提取和分析，整个装置如图1 所示。 (a) (b) (c) 3 图1.(a)装置图；(b)RAM原理；(c)RAM产物浓度梯度电泳 左起DL2000 marker ，对照，10 ， 4 5 6 7 8 10 ,10 ,10 ,10 ,10 拷贝mir-122 2010年微纳尺度分离和分析技术学术会议暨第六届全国微全分析学术会议 用于microRNA 表达分析的RAM 检测方法的原理如图1(a)所示[5]，该方法需要经过反 转录，连接和 RCA 三步反应，期间需要加入多种酶和试剂，反应温度分别为 41°C ，55°C 和65°C，上述步骤均可在阵列芯片上实现。 以肝脏特异性表达的m