一种磷脂酶A2抑制剂体外高通量筛选方法建立.pdfVIP

一种磷脂酶A 抑制剂体外高通量筛选方法的建立 2 朱京童 郑智慧 路新华 范玉玲 张华 贺建功 （华北制药集团新药研究开发中心，微生物药物国家工程研究中心 石家庄050015 ） 摘要：目的：磷脂酶 A (PLA )是一个重要的抗炎和心血管疾病药物靶点，本研 2 2 究拟建立一种荧光的磷脂酶A (PLA )抑制剂体外高通量药物筛选方法。方法： 2 2 以7-Hydroxycoumarinyl-arachidonate 为荧光底物，水解产物在 355ex/460em 下 有特定荧光，间接反映酶活性。利用96 孔板，通过对酶浓度、反应时间等多个 条件的优化，摸索最佳的反应条件。利用阳性药二乙烯三胺五乙酸进行模型验 证。结果：在酶浓度2.25U/ml、底物浓度30µM 和反应时间 30min 时，为最适 反应条件。阳性药在该模型上表现出好的浓度剂量依赖抑制效果，IC50 为 0.37 µmol/L 。利用该模型，本研究从微生物次生代谢产物筛选得到两个活性化 合物F02ZA-2396A、F02ZA-2396B，其IC50 分别为 152µM 和 72µM 。结论：本 研究建立了一个高通量的磷脂酶A2 抑制剂体外药物筛选方法，该方法灵敏、快 捷、可操作强，可用于各种来源的化合物的快速活性筛选。 关键词：磷脂酶A2 ；抑制剂；体外；荧光法 A fluorescence-based method on the high throughput screening assay for PLA2 inhibitor in vitro Zhu Jing-tong, Zheng Zhi-hui, Lu Xin-hua, Fan Yu-ling, Zhang Hua, He Jian-gong (New Drugs Research Development Center of North China Pharmaceutical Group Corporation, National Microbial Medicine Engineering Research Center, Shijiazhuang 050015) ABSTRACT: OBJECTIVE: To establish a fluorescence-based method in vitro for high throughput screening phosphplipase A (PLA ) inhibitor. METHODS: using 7- 2 2 Hydroxycoumarinyl-arachidonate as a fluorescent substrate ，to determine the activity of phosphplipase A by measuring the 355ex/460em fluorescence value in 96-well microplates, The 2 effect of positive drugs and samples on phosphplipase A activity were evaluated. RESULTS : 2 With 2.25U/ml concentration of the enzyme, 30µM concentration of the substrate and 30 min reaction time, there is a dose-depe