基于肠出血性大肠杆菌EHEC+O157：H7+EspA的高效融合表达载体的设计、构建与应用研究.pdfVIP

0157：H7 基于肠出血性大肠杆菌EHEC EspA的 高效融合表达载体的设计、构建及应用研究 程 琰 毛旭虎 王庆旭 余 抒 刘艳青 张晓丽 宁亚蕾 邹全明 第三军医大学检验系临床微生物及免疫学教研室暨重庆市生物制药工程技术研究中心，重庆，400038 摘要 目的构建基于EspA(肠出血性大肠杆菌0157：H7Ⅲ型分泌蛋白A)的高效原核 融合表达载体，并对此载体的通用性和应用性进行研究。方法在EspA的羧基端设计一Lin— 叠延伸PCR技术获得二者融合基因，T—A克隆后插入表达载体pET一28a(十)，构建高效原核 BL21(DE3)， 表达载体一pEspA。分别将IL-24、GFP等六种基因克隆入pEspA，转化E．coli 经亲和层析纯化后进行肠激酶酶切实验，酶切后样品离心取上清进行SD孓PAGE检测。融合 蛋白EspA—Stx2A1经纯化复性后，分别从免疫原性和免疫保护性两个方面对融合蛋白的生物 学活性进行研究。结果构建的pEspA可高效表达外源舀的蛋白。融合蛋自EspA—GFP、Es— pA—IL-24经肠激酶酶切后，SDS均可检测到目的蛋白条带，提示酶切成功。纯化、复性 后的融合蛋白EspA—Stx2A1具有良好的免疫原性，在体内和体外均具有良好的免疫保护效 果。结论成功构建了基于EspA的新型高效原核融合表达载{本，此载体的构建不仅方便 EHEC 0157：H7基因工程多亚单位融和蛋白疫苗的研究，也为构建具有自主知识产权的高 效、稳定、低成本、易纯化的重组蛋白表达系统奠定基础。 关键词EspA；融合表达载体；肠出血性大肠杆菌0157：H7 在生命科学研究和生物制药、生物制品的生产 EspA在大肠杆菌工程菌中易于高效表达，表达量 中，利用表达载体制备重组蛋白是重要而关键的环 可达到40％酮]。此外，还发现Stx2A1亚单位在很 节，获得足够量的重组蛋白是进行后续研究和生产 的必要条件。构建有效的表达载体是表达目的基因 的基本要求，同时也是影响基因表达水平以及蛋白 的形式获得表达。由此，我们推测EspA是否可以 活性的重要因素。目前有许多商业化的表达载体可 促进原核表达系统高效表达外源目的蛋白，使本身 用于重组蛋白的表达、生产及后续研究，然而，缺乏 不表达或表达量低的目的蛋白得到高效表达。 具有自主知识产权的高效、稳定、低成本、易纯化的 有鉴于此，本研究拟构建基于EspA的高效原 重组蛋白表达系统是目前基因】：程药物／疫苗研发、 核融合表达载体pEspA，并验证此载体的通用性。 0157：H7基因工程 生产和相关生物技术的瓶颈之一。 pEspA的构建不仅方便EHEC 多亚单位融和蛋白疫苗的研究，而且为构建具有自 肠出血性大肠杆菌0157：H7分泌蛋白A coli 主知识产权的高效、稳定、低成本、易纯化的重组蛋 (Escherichiasecret proteinA，EspA)为Ⅲ型分 泌系统的重要元件，不仅在细菌黏附过程中发挥关 白表达系统奠定基础，同时也为进一步研究EspA 的功能提供依据。 键性的启动作用，也在形成A／E损伤的效应分子传 递中起到桥梁作用[1q]。EspA是一种外膜蛋白，具 材料与方法 有良好的免疫原性和免疫反应性“‘5]，研究表明Es—