重组人内抑素单克隆抗体的制备及初步鉴定.pdfVIP

· 512 · 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui20080ct；43(5) 重组人内抑素单克隆抗体的制备及初步鉴定 魏文杰 ，陈飞虎 ，沈际佳 ，廖法学 ，朱绍春 摘要 目的 制备抗重组人 内抑素 (Es)单克 隆抗体 化物酶(HRP)标记 的山羊抗小 鼠IgG、HAT和HT (McAb)并进行鉴定。方法 利用重组人Es为抗原，免疫 购于 Gibco公 司；胎 牛血清，购于 Hyclone公司； Balb／c小鼠，应用杂交瘤技术将免疫小鼠的脾细胞与同源小 BALB／c小鼠购于安徽省实验动物中心；SP2／0骨髓 鼠骨髓瘤细胞 (SP2／0)进行融合，间接ELISA法对细胞培养 瘤细胞为基础医学院沈际佳教授惠赠；肿瘤组织与 上清进行筛检，对能稳定分泌抗重组人Es的细胞株，进行扩 相应的正常组织为安医大附院病理科惠赠。DAB 大培养。体内诱生法制备腹水并对其初步鉴定。结果 获 显色剂购于北京博奥生物技术有限公司。 得3B、1D10、1G 、2D。，4株能稳定分泌抗重组人 ESMcAb 的杂交瘤细胞株，并对 3B 和 1D．。两株给予鉴定，其免疫亚 1．2 杂交瘤细胞株的建立和筛选 1．2．1 动物免疫 选用 SPF级，6～8周早BALB／c 型为IgG2a、IgG3。腹水ELISA效价为 10。‘’、10～。通过蛋白 免疫印迹法和免疫组化证明抗体有特异性和敏感性。结论 小鼠。首次免疫，使用弗氏完全佐剂与等量的重组 成功制备分泌抗重组人Es的杂交瘤细胞株，为研究人 Es 人 Es混合，充分乳化后，经皮下多点注射，每只合 的表达及相关领域奠定了基础。 计抗原量50～100 g，间隔2周，用弗氏不完全佐剂 主题词 抑制素类；抗体 ，单克隆／生物合成 与初次免疫等量抗原混合乳化，操作同前。经3次 中 图分 类 号 R 341．32；R 977．6；R 392；R 392．11； 免疫后，4～5d断尾取血，用间接 ELISA检测血清 R394．2 效价。选择血清效价高的小鼠做融合，融合前3d 文献标识码 A 文章编号 1000—1492(2008)05—0512一o4 加强免疫，尾静脉注射重组人ES100 g，不加佐剂。 1．2．2 细胞融合 SP2／O细胞经8一氮鸟嘌呤筛选， 研究表明肿瘤的生长、浸润和转移与新生血管 再用普通培养基培养 1周；无菌取免疫小 鼠脾脏， 有着必然的联系，新生血管的生成受到许多正负因 200目铜网研磨得到细胞悬液。通过细胞计数，骨 素的调控…。内抑素(Endostatin，ES)是 目前已知作 髓瘤细胞与脾细胞按 1：3～5混匀，加入450g／L 用强、选择性专一的内源性血管形成抑制因子 。 PEG40000．8ml，进行细胞融合约 90S。再加入 有关文献报道，ES水平与肿瘤大小存在一定的相关 37℃预热的无血清培养液 10ml进行终止。离心弃 性 ]。通过检测肿瘤患者血清中ES水平，将有助 液，用HAT培养液重悬，加入含饲养层细胞的96孔 于诊断、治疗和疗效预后的评估。本研究试图以重