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免疫荧光检测轮状病毒Vp6在 真核细胞中的合成与分布 尹兴晓文喻玲赵庆欢 于洋陈元鼎 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所，昆明，650118 抗体作为间接免疫荧光的捕获抗体，检测SAIl病毒感染的MAl04细胞中表达的病毒Vp6蛋白，观察Vp6在 细胞内的复制及其分布情况。结果显示运用免疫荧光法检测轮状病毒感染的MAl04细胞具有较强的特异性 和敏感性。本研究对于轮状病毒感染细胞机制及病毒在细胞内的组装过程的进一步研究具有指导意义，同时 对于重组蛋白应用于临床检测奠定了一定的实验基础。 【关键词】轮状病毒；V06；重组表达；免疫荧光 杆菌BL21(DE3)表达。经进一步纯化，重组表达的 轮状病毒(mtavirus，RV)是世界范围内婴幼儿 腹泻病的最主要病原，每年至少有60万病人死于 RV腹泻，其中80％发生在发展中国家…。近年来各重组表达与纯化详见文献[4]。 1．2．2 国对RV各方面进行了深入的研究，发展了大量不 SAll病毒的增殖与纯化：SAll病毒液用 同敏感度的检测RV的方法[2J，为RV的深入研究提 供了大量的实验基础。 Vp6是Rv中含量最丰富的蛋白，约占病毒总蛋细胞，每瓶加0．5ml。37℃吸附lh后，加入不含小牛 白量的51％[3]。在A组轮状病毒中该蛋白由第6基 因片段编码，分子量约为45kDa，由397个氨基酸组 左右细胞出现CPE时收获，反复冻融三次后，离心收 成。其定位于衣壳中间层的主要结构蛋白，在病毒 集上清，PEG浓缩病毒液后使用氯化铯密度梯度离 粒子衣壳中以三聚体形式存在。Vp6具有组和亚组 心纯化轮状病毒，具体步骤见文献[53。 抗原特异性，是病毒的组抗原和亚组抗原蛋白，因此 在轮状病毒的诊断及鉴定中具有重要的实际意义。 清的制备：豚鼠进入实验室适应培养一周后，第一 本研究报道用抗重组表达的A组人RV Vp6及次免疫纯化的重组Vp6抗原蛋白(20Q一只)或纯化 抗SAll抗体检测了不同时间段SAll株RV在 MAl04细胞中的感染和分布情况。本方法可直观的(200赳只)经大腿肌肉注射。第二次与第三次免疫 观察病毒在不同时间段感染MAl04细胞的情况，帮 按与第一次免疫相同的抗原剂量经大腿肌肉注射。 助了解及分析病毒的基本生物学特性，并对重组RV 第三次免疫10天后，进行心脏取血。采集的血样分 蛋白vp6的免疫学特性作进一步研究。 别在37℃放置30分钟，4℃1小时。然后在4℃， 1．材料与方法 8000rpm离心20分钟，收集上清于．20X：保存备用。 1．1材料试剂 1．2．4免疫荧光检测轮状病毒在感染细胞中的 异硫氰酸荧光素(fluoresceiisothiocyanate，F兀℃)标 胞用胰酶消化后，每瓶细胞加入30ml营养液，吹打 USA公司。RV病毒株 记的羊抗豚鼠IgG购自KPL 均匀后，将每瓶细胞液接种于加有盖玻片的双碟中， SAIl由本实验室保存。MAl04细胞由本实验室保 5％C02孵箱培养。待细胞长成单层后，用PBS洗 存。抗Vp6及抗SAll病毒的抗豚鼠血清由本实验 室制备。 细胞两次，细胞维持液(不加小牛血清的MEM培养 1．2方法 液)洗一次，将盖玻片转至六孔板中，加维持液lml。