改进MSP法对肿瘤患者血清DNA检测.pdfVIP

124 中国癌症研究进曼@ 改进MSP法对肿瘤患者血清DNA的检测 捌采曷孙傻宁粱小波刘清傻程玉英 近10年来许多研究证据表明，肿瘤DNA存在于病人周围血中，尽管其释放人血的确切途 径还不清楚，但其存在与否及多寡能反映出人体对肿瘤的负荷。至于用于在血流中检测的靶 分子则以K一一，p53的突变及微卫星DNA不稳定和杂合性缺失最为普遍。近来有人应用某 些肿瘤抑制基因启动子高甲基化或肿瘤相关病毒来检测血液中肿瘤DNA的存在。P16基因 启动子区域5’cpG岛甲基化现象是该基因失表达的主要机制之一…。国内已有少数用限制性 内切酶酶切的方法对P16甲基化进行检测的报道+但其枪出率均相对较低。 PCR，MSP)法对11l例肿瘤患者循环血液中的 我们采用了改进的MSP(methylationspecific 基因的检测。 现将方法及检测结果报告如下。 材料与方法 (一)材料 者47例，晚期复发患者52例，术后20d左右的患者12例。另选取献血员20例及非恶性肿瘤 患者13例作为对照。每人抽取静脉血2IIll，不加抗凝剂送检。另取手术标本：癌组织13份、 癌旁组织11份作对比观察。 {二)实验方法 1．DNA的提取将未抗凝血置4℃24h后分离血清。取血清400m依次加人TES300m， 10％SDS h后用酚抽提法提取DNA。组织DNA的 50m，蛋白酶K100懈，370C保温消化2—3 提取方法为本室常规。 2．DNA甲基化将以上制备之DNA加蒸馏水至50一，加人鲑鱼精DNA 1旭混匀后放人 1006C水浴煮5min，迅速投入冰水中10min。取出后依次加入新鲜配制的10mmol／L间苯二酚 h。 3．甲基化后纯化每管加入0．3％明胶500 m，混匀后过柱(上海生工)，洗涤液洗涤2次， 弃残留，换接1．5nll管，在柱中加入65℃的1E50m，于65℃放置lrain后离心，弃去柱子即获 醋酸钠，预冷的乙醇沉淀DNA。 作者单位：030013太原，山西省肿瘤研究所(刘永昌孙俊宁)：山西省肿瘤医院(粱小渡刘请俊程玉荚) 改进孵P法对肿瘤患者血清DNA的检测 物序列为：P16一MF：5 ^GC^ccCA一3’；P16一IR：5’一GCGCTACCTGATIECAATI[c一3’。 5．酶切反应在15 m酶切反应液中含有IO}d h。 I。反应条件为65℃2 P16一U均能扩增出一条243bp的条带，如在凝胶上有243bp的带即判断为阳性。P16一M阳 性加P16一U阴性即为完全甲基化，判为异常甲基化；两者皆阳性则为不完全甲基化，判为可 疑；P16一M阴性加P16一U阳性则为非甲基化，判为阴性。P16一I的条带为280bp，凡未经甲 基化处理的标本均应扩增出这一条带，以此来作为内对照，判断实验是否成功。P16一M产物 经1铀I酶切可产生204bp，226bp，与17bp三种片段，用以检验产物是否甲基化。 7．K—m基因突变检测突变K—m基因的引物设计及扩增条件参照文献”1并加以改 含有扩增产物lOm，MvaI酶10个单位以及反应缓冲液。置于60℃90mln；完成后再加人 Mva 环数为35个。将第二轮产物再做酶切两次的处理后进行电泳。野生型K—m不做酶切，产 生157t,p的条带，用以作为内对照。突变型K—m则产生142bp的条带，如无特异带则判为 阴性。 结 果 I_一)各种标本P16基因异常甲基化的检测结果 见表1。 囊I不同标本H6基西异常甲基北状态的分布f露l