环境荷尔蒙物质2%2c4-D+荧光免疫分析技术的研究.pdfVIP

第三届全国环境化学学术大会论文集 A-68 环境荷尔蒙物质 2,4-D 荧光免疫分析技术研究∗ ∗∗ 余宇燕 庄惠生 东华大学环境科学与工程学院，上海 200051 关键词：2,4-D, 人工抗原, 多克隆抗体, 荧光免疫分析 分类：环境分析化学/监测新技术方法 1 引言 自从 1941 年合成了第一个苯氧羧酸类除草剂的品种 2,4-D ，其在世界范围内得到广泛 的运用，研究表明它属于环境荷尔蒙物质[1]，具有类雌激素的作用，可干扰内分泌系统，导 致生物体的生殖能力下降。近年来环境荷尔蒙问题已成为环境、生物、化学和医学领域的交 叉研究热点。免疫分析技术以其灵敏度高、线性范围宽、仪器简单和快速方便等特点，在环 境小分子物质残留分析中具有巨大的潜力。目前，国内外有文献报道[2,3] 了 2,4-D 的免疫分 析和监测研究，本实验室也对其的化学发光免疫进行过研究，但其荧光免疫研究还未见报道。 本文目的是建立了一种测定 2,4-D 的荧光免疫测定新方法。 2 实验部分 2.1 材料与仪器 2,4-D ；牛血清白蛋白(BSA，MW67000 ，华美生物工程公司) ；卵清蛋白(OVA，MW43000 ， 华美生物工程公司) ；异硫氰酸荧光素（美国Solon公司）；饱和硫酸铵溶液； 缓冲溶液：0.05mol/L pH9.6 碳酸盐缓冲溶液 CBS(Na CO 1.59g，NaHCO 2.39g ，加蒸 2 3 3 馏水至 1L)；0.01mol/L pH7.4 磷酸盐 PBS(Na HPO .12H O 2.91g，NaH PO .2H O 0.30g，NaCl 2 4 2 2 4 2 8.50g，加蒸馏水至 1L)；pH4.0 乙酸-乙酸钠缓冲溶液( 0.2 mol/L 乙酸 30mL，0.2 mol/L 乙酸 钠 70mL，混均) 高速离心机(上海安亭科学仪器厂) ；；PHS-3C 型精密 pH 计(上海精密科学仪器有限公 司) ；TU-1800 双光束紫外分光光度计( 北京普析通用仪器公司) ；Flx-800 荧光酶标仪 (BIO-TEK)；磁力搅拌器；微量移液器；96 孔荧光酶标板 2.2 实验方法 2.2.1 2,4-D 人工抗原的合成和鉴定 本实验采用活化酯法合成人工抗原，称取 2¸4-D （110.5mg,0.5mmol）溶于2mL DMF 中， 将 NHS(57.5mg,0.5mmol)与 DCC(103.15mg,0.5mmol)溶于 5mLDMF，逐滴加入 2,4-D 溶液中， 0 4 C 搅拌过夜反应 18h，5000r，10min 离心取上清液。取 75mg BSA 溶于 5mL PBS 缓冲液， 滴加 0.5mL 上清液，室温搅拌 4h ，反应液装入透析袋，蒸馏水透析2d ，PBS 溶液透析 3d 。 5000r，10min 离心，上清液冷冻保存。即得人工抗原 2,4-D-BSA 。 2.2.2 抗血清的制备和纯化 将免疫原 2,4-D-BSA 免疫新西兰白兔获得抗血清，采用辛酸-硫酸铵二步盐析法[4]纯化 抗体，经过葡聚糖凝胶柱除盐，纤维素柱离子交换后，冻干于-20ºC 保存。 2.2.3 荧光抗体的制备与鉴定 取 100mg 2,4-D-IgG冻干粉溶于5ml pH9.6 CBS 中。另取FITC 1mg 溶于0.5mL pH9.6CBS 中，搅拌下滴入抗体稀释溶液，室温 200C 标记 4h 。反应毕，以 PBS 透析 5d 。当荧光素与 蛋白比例适当时，低标记部分很少，可直接过 DEAE-32 纤维素层析柱，以 0.01mol/L pH7.6 ∗本文系国家自然科学基金资助项目 ∗∗ 通信联系人：庄惠生，教授，博士生导师