高产碱性蛋白酶工程菌的构建及鉴定木.pdfVIP

第 l9卷 哈尔滨师范大学 自然科学学报 Vo1．19，No．42003 第4期 NATURAL SCIENCESJOURNAL OF HARBIN NORMALUNIVERSⅡY 高产碱性蛋 白酶工程菌的构建及鉴定 木 潘延云 周艳芬 张贺迎 吴宝东 (河北大学，河北师范大学) (河北大学) 【摘要】 利用原生质体融合技术，使碱性蛋 白酶生产茵2709与枯草杆茵 BD105(含有碱性蛋 白酶基 因克隆载体 pDW2)杂交，得到 l株高产碱性蛋 白酶的工 程茵AI6．A16的表型与生长特征与2709相似，相 同条件下发酵酶活性比2709茵株 高50％，摇瓶发酵的产酶水平最高可达 30000u／mL．用茵落的原位杂交鉴定出该茵 株携有双亲的遗传物质． 关键词 ：原生质体融合 ；碱性蛋 白酶；地衣芽孢杆菌2709 地衣芽孢杆菌 (且 licheniformis)2709是用于 pMK4，碱性蛋 白酶基 因克隆载体，在革兰氏 发酵产生碱性蛋 白酶生产用菌 J．它所产生的碱性 阳性菌中表现为 Cm ，本室保存 ；pDW2，pMK4与 蛋 白酶为卡尔斯伯革型 (subtilisincarsberg)，是一 碱性蛋 白酶基 因的重组体，本室克隆 9【；B．1i- 种丝氨酸蛋 白酶 ，有很强的分解蛋 白能力和较低 cheniformis2709，碱性蛋 白酶生产菌，表型为 His 的底物特异性 ，最适 pH值为 lO～ll，被广泛地用 Cm ，‘天 津 酶 制 剂 厂 惠赠 ；B．subtilisBD 105 于洗涤剂、皮革和丝织业等领域．为了提高产酶效 (pDW2)，表型为 His—Cm ，本室构建 9【】． 率 ，多年来新菌种的构建及选育工作层出不穷 ，其 1．2 培养基 原生质体制备及再生用培养 中多是采用诱变筛选方法 ¨-8J．蛋 白酶基因的筛 基 l【，DM3培养基 中加入 Cm50mg／L及 M9培 选 、克隆和表达 的研究也相继进行 9【引，用分子 养基用于再生融合子的筛选 ；用于原生质体的融合 生物学手段改造菌株的研究也多见报道 J引．吴 的PEG溶液 ，在 SEM 中加入40％的PEG6000；摇 宝东等以C。：。。(2709菌株的一突变株)为材料克 瓶发酵培养基 l【用于2709与融合子的发酵和产 隆了2．3kb的能独立表达的碱性蛋 白酶基因，构 酶性质的研究 ． 建为 pDW：克隆载体 J，我们在此基础上 ，采用原 1．3 酶和试剂 溶菌酶和 BSA购 自华美生物工 生质体融合 的技术 ，将碱性蛋 白酶基 因工程菌 程公司．PEc6000为 日本产品．探针标记物及酶 BD105(pDW2)与该基因的出发菌株 联染色试剂购 自北京军事医学科学院．其他为国 B．／c／henf／orm／s2709进行原生质体 的融合 ，获得 产分析纯试剂 ． 了l株蛋 白酶 高效表达且适合于工业生产的工 1．4 方法 程菌． 1．4．1 且 lichenfiormis2709和 B．subtilisBD105 (pDW2)原生质体的制备、再生及 BD105(pDW2) 1 材料与方法 的紫外灭活 原生质体 的制备和再生按冯 ¨的 1．1 菌株与质粒 方法．BD105(pDW2)的紫外灭活按文献 [1]的 收稿 日、期 ．2003-04-03