日本脑炎病毒基因Ⅰ型与Ⅲ型复合RT-PCR鉴别方法的建立.pdfVIP

四川省畜牧兽医学会2014年学术年会 日本脑炎病毒基因I型和Ⅲ型复合RT—PCR 鉴别方法的建立 张 亮1’2 刘：漳}扬1’2 石双艳卜2 袁 磊卜2 伍锐1’2’3黄小波1’2，3文翼平卜2·3 文心田卜2’3 曹三杰∽’3+ (1．四川农业大学预防兽医研究所猪病研究中心，四川雅安625014； 2．四川农业大学动物医学院人兽共患病研究室，四川成都611130； 3．农业部兽用药物与兽医生物技术四川科学观测实验站，四川雅安625014) 摘要为建立一种简单快捷的鉴别日本脑炎病毒(JEV)基因I型和基因Ⅲ型的方法，本研究根据基 P2／P3，以JEV 示，以设计合成的引物进行复合RT．PCR扩增，基因I型JEV得到与预期相符的38l bp的特异性条带，基因 Ⅲ型JEV得到与预期相符的550 bp的特异性条带，而对猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、 猪圆环病毒及猪伪狂犬病毒的核酸扩增结果均为阴性；敏感性试验结果显示，该方法对基因I型和基因Ⅲ型 JEV的最小检出量分别为2．0pg和20pg；利用建立的复合RT．PCR方法对27份临床样品检测结果显示其 中5份为基因I型，2份为Ⅲ型，与核苷酸序列分析结果一致。结果表明，建立的复合RT—PCR方法具有特异 性强、敏感性高、快速简便等特点，可用于检测及鉴别基因I型和基因Ⅲ型JEV。 关键词 日本脑炎病毒；复合RT—PcR；基因I型；基因Ⅲ型；鉴别 日本脑炎(Japanese en- cephalitisvirus，JEV)引起的一种以三带喙库蚊为主要传播媒介，严重威胁人畜健康的一种中枢神经系统急 性传染病。猪是JEV的主要增殖宿主和扩散宿主，JEV是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一，JEV对猪的致 死率不高，但能引起怀孕母猪流产、产死胎或木乃伊胎，也能引起公猪睾丸急性炎症反应或不育，给养猪业带 来了巨大的经济损失，疫苗预防接种是控制本病的主要措施。JEV基因组为单股正链RNA，全长约11kb， 由5’端非编码区，一个几乎跨越整个基因组的单一开放阅读框(ORF)及3’端非编码区构成。0RF编码一个 型：基因I型、基因Ⅱ型、基因Ⅲ型、基因Ⅳ型和基因V型。研究表明，直到20世纪末期，在我国流行的主要 基因型都是基因Ⅲ型，在2000年后，部分地区陆续出现基因I型，在某些地区基因I型甚至成为主要基因 传变异、基因型及与现行使用的日本脑炎疫苗株之间的差异等提供了科学依据，具有重要意义。 本研究通过对基因I型和基因Ⅲ型日本脑炎病毒核苷酸序列的分析，分别设计了1条基因型特异性上 基金项目：公益性行业(农业)科研专项经费项目(201203082) 作者简介：张亮(1990一)，男，重庆开县人，硕士生，E—mail：zhangliarI萨15@163．com。 枣通讯作者：曹三杰，教授，博士生导师，博士，E—mail：csanjie@gmail．com。 游引物和1条共用下游引物，建立了一种复合RT—PCR方法，该方法可根据扩增片段的大小快速对基因I型 和基因Ⅲ型日本脑炎病毒进行鉴别，为研究JEV在我国的流行情况等提供了一种特异、灵敏和高效的方法。 1材料与方法 1．1 毒株、菌株和载体 19．T载体为大连宝生物工程有限公司产品。 均为四川农业大学猪病研究中心保存。pMD 1．2 主要试剂 2xzT叼PCR DNA 试剂盒、T4DNA连接酶、DL2000Marker均为大连宝生物工程有限公司产品。DNA凝胶回收试剂盒 GelExtraction MiniKit (E．Z．N．A．DNA Kit)、小量质粒提取试剂盒(E．Z．N．A．PlasmidI)均为Omega公司产 品。 1．3样品来源 2012年至2013年采自四川省部分猪场的蚊虫及猪流产胎儿脑组织样品共27份。 1．4 引物设计 行序列比对分析，分别以JEVCZl株(GenBank登录号：HM234673)和JEV