在PCR—DGGE研究土壤微生物多样性中应用GC发卡结构的效应.pdfVIP

第 23卷第 10期 生 态 学 报 Vo1．23．No．10 2003年 10月 ACTA ECOLOGICA SINICA 0ct．．2003 在 PCR—DGGE研究土壤微 生物 多样 性 中应用 GC发卡 结构 的效应 罗海峰 ，齐鸿雁 ，薛 凯，王晓谊 ，王 川 ，张洪勋 (中国科学 院生态环境研究 中心环境生物技术研究室 ，北京 100085) 摘 要 ：应用普通细胞 裂解 法提取 3株实 验菌株 (EscherichiacoliDH 5u．Staph3，lococcusaureusSA一1和 Agrobacteriumtumerfaciens13129)的基 因组 DNA和应用基于高盐和长时高热 的细胞裂解法提取 7种不 同土壤样 品中的微生物的基 因组 DNA，两组不 同结构 的引物 F GC，R (在正 向引物 的 5端有 GC发卡 结构)和 F ．Rm ，分别对实验菌株和土壤样 品中微生物的 16SrRNA基 因V3区进行扩增 ，均得到 了 目的 片段 。比较 了不 同引物扩增 的 16SrDNA 片段在 DGGE中的不 同电泳行为 ．结果表 明，含 GC发卡结构的 PCR扩增产物在 DGGE 中能够得到很好 的分离 ．而无 GC发卡结构 的 PCR产物则不能在 DGGE 中获得 满意分离 。引入 GC发卡结构 ，使得对不 同微生物 的定性和分类更深入细致 。 关键词 ：PCR—DGGE；微生物多样性 ；GC发卡结构 Influence of application of GC—clamp on study of soilm icrobial diversityby PCR—DGGE LUo Hai—Feng，QIHong—Yan，XUE Kai，W ANG Xiao—Yi，W ANG Chuan，ZHANG Hong—Xun (EnuironlentalBiotechnologyLab．，ResearchCenter IrEco—EnttiromnentalSciences，ChineseAcademy ofSciences，Beijing，100085．China)．ActaEcologicaSinica，2003，23(10)：2l70～2175． Abstract：Asa new DNA fingerprinting technique，denaturing gradientgelelectrophoresis (DGGE)was used to analyzethe microbialdiversity in differentenvironm entalsamples．which hasgiven people new ideasofstudying the m icrobialcommunity in soil． Thistechnique is based on thedirectextraction of genomicDNA from soilsamples．theamplificationof16S rRNA genes (V3region)byusing thespecific primers and the separation ofthe PCR products by DGGE． Three strains (Escherichia coliDH 5u， StaphylococcusaureusSA一1andAgrobacterium turnerfaciens13129)andsevensoilssampledindifferent placesanddifferentdepthswereused inthisstudytoevaluatetheinfluenceofGC clampon theresultof bacterialdiversitybyPCR—DGGE．Thegenom icDNA ofthreestrainsandthesoilsampleswereextracted byatraditionalcelllysismethodandacelllysismethodbasedonthehighNaC1(1．5mol／L)