ncu创新学分转基因大豆的检测.docVIP

组员：温正新、张星、姜文峰、葛磊、高顺利、曾伟 主要完成人： 转基因大豆的检测试验结题报告 摘要：由于转基因大豆在社会上的普遍性和重要性，以及民众对转基因食品的担忧，本次研究针对样品大豆的基因中是否含有抗草甘膦基因而成为转基因大豆进行了检测。对于转基因大豆的检测的主要方法是PCR扩增大豆DNA，通过琼脂糖电泳后在紫光灯下观察是否有相应的DNA色带来判断大豆是否为转基因大豆。 关键词：转基因、DNA、PCR 一、?研究意义 随着转基因工程技术的迅速发展与在生物改良及遗传育种中的大规模应用，转基因生物（Genetically?Modified?Organism）及其产品的种类越来越多，含有的外源基因类型也越来越多。抗草甘膦（glyphosate）大豆（商品名，roundup?ready?soybean）是在传统大豆株Variety?A5403中转入外源基因CAMV-35S启动子、抗草甘膦基因CP4-EPSPS和NOS终止子而得到。大豆是植物蛋白、油脂、食品、饲料及工业原料的重要来源作物。仅排在水稻、小麦和玉米之后， 是世界四大粮食作物之一。自从1996 年第1 个转基因抗草甘膦大豆品种商业化种植以来， 转基因大豆在世界范围内迅速推广。转基因大豆的种植在带来巨大经济效益的同时， 食品和环境安全性的潜在风险受到广泛关注。目前，全球种植面积最大的转基因作物为抗除草剂大豆，占全球大豆种植面积的67%。它是目前使用最广的转基因作物之一，每年至少有800万吨转基因大豆进入我国市场。因此，研究抗草甘膦大豆的快速检测方法具有重要意义。当前，转基因大豆商业化种植的主要品种美国抗除草剂草甘膦转基因大豆是通过农杆菌介导方法， 将矮牵牛Ti 质粒（CaMy）中35S 启动子控制EPSPS 基因导入到大豆植株， 进而培育成的新品种。基于核酸的检测技术主要有PCR?方法和基于PCR?原理的其他检测方法如多重PCR、巢式PCR?等?等。普通PCR?方法已经成为转基因检测中常用的方法，通常是作为定性检测方法，早在2003?年就成为出入境检验检疫系统的行业标准。这些标准涉及的转基因作物有大豆、玉米、棉花、油菜籽、烟草?和马铃薯。目前广泛应用于进出口商品的转基因成分检测。随后在2004?年又制定了转基因定性检测的国标(GB/T?19495.4-2004)，?该国标中用的方法还是普通?PCR。因此，普通PCR?方法的研究主要在于新的转基因作物的鉴定研究。本实验以两种大豆为材料进行比较，通过对其DNA的提取和纯化，靶标基因的获取及琼脂糖电泳分析，从而鉴定所检测大豆样品。采用PCR检测转基因大豆的方法，主要是采用琼脂糖凝胶电泳法，检测抗草甘膦基因。 研究目的： 1、掌握用CTAB法提取真核细胞总DNA的原理、步骤和注意事项。 2、PCR扩增的凝胶电泳分离可得到大豆Lectin基因片段的方法。 3、?掌握琼脂糖电泳的基本技术。 4、了解琼脂糖凝胶电泳的原理。 三、样品来源：? 1、抗草甘膦转基因大豆粉 2、非转基因大豆粉 四、研究内容： （一）核酸的提取和纯化（CTAB法） 1.样品来源：? （1）抗草甘膦转基因大豆粉 （2）非转基因大豆粉 2.实验原理? （1）?CTAB(hexadecyltrimethylammonium?bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(0.7mol/L?NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。? （2）?CTAB提取缓冲液各成分的作用：? 1）Tris-HCl?(pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏? 2）EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性? 3）NaCl?提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中? 4）Cβ-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除基因组DNA? 5）主要作用物质就是氯仿，所以它占有的比例较大，而异丙醇的主要就是防止起泡。? 3.?实验仪器和实验试剂? （1）仪器：水浴锅、?离心机、EP管、电泳仪?? （2）试剂:?去离子水、乙醇、?氯仿-异丙醇（24V:1V）、异丙醇、CTAB缓冲液、TE缓冲液 （3）溶液成分： CTAB缓冲液：CTAB?20g/L、Tris-HCI?0.1?mol/L(pH8.?0)，?EDTA??0.02?mol/L.? TE缓冲液：lo?mmol/L?Tris.，1?mmol/I,??EDTA，?pH8.0).?? 材料：抗草甘膦转基因大豆粉、非转基因大豆粉 ?4.实验步骤（两种