CRK是PTPN4新的相互作用蛋白.pdfVIP

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第47卷 第5期 复 旦 学 报 (自然科学版) Vo1.47No.5 2008年 l0月 JournalofFudanUniversity(NaturalScience) Oct.2008 文章编号:0427—7104(2008)05—0576—09 CRK是 PTPN4新的相互作用蛋 白 周 娟,万兵兵,单敬轩,吴冬华,施慧莉,霍克克 (复旦大学 生命科学学院遗传学研究所 遗传工程国家重点实验室,上海200433) 摘 要:以PTPN4为 “诱饵”,利用酵母双杂交系统筛选人肝 cDNA文库,获得了一个与 PTPN4相互作用的蛋 白:CRK工.从cDNA文库中通过 PCR得到CRK家族的3个成员的基因,把这3个基因与PTPN4共转酵母,发 现CRKI、CRKlI和CRKL均能与PTPN4发生很强的相互作用.通过截断体证实它们之间的相互作用是通过 CRKs的SH3结构域与PTPN4的462--468位的脯氨酸富集区介导的.免疫共沉淀以及免疫荧光共定位实验进 一 步证实了CRKI与PTPN4的相互作用.通过酪氨酸磷酸化特异性抗体检测发现PTPN4可以明显降低CRK I的磷酸化水平. 关键词:PTPN4;CRKI;CRKII;CRKL;酵母双杂交;免疫荧光定位;酪氨酸磷酸化 中图分类号:Q71 文献标识码:A 蛋白质磷酸化是一种重要的翻译后修饰过程,它参与和调控生物体内的许多生命活动.在生物体内, 蛋白质酪氨酸磷酸酶(FrrPs)与蛋白质酪氨酸激酶(FrrKs)共同参与了蛋白质的磷酸化与去磷酸化这个可 逆的动态过程_1,2一,相当于信号转导通路的分子开关,通过调控蛋白的酪氨酸磷酸化水平,调节细胞生长、 分化、代谢等过程.迄今为止,对蛋白质酪氨酸磷酸酶的研究还远远滞后于蛋白质酪氨酸激酶. 现今已发现38种蛋白质酪氨酸磷酸酶,其中包括21种受体酪氨酸磷酸酶和 l7种非受体酪氨酸磷酸 酶E3,4j.前者含有一个胞外配体结合区、一个跨膜区和一个或两个 PrrP胞浆区.后者的结构包括一个单独 的催化区和包括SH2在内的多种氨基端或羧基端延伸区,该区可能有靶向或调控功能. PTPN4是一个有多种生物学功能的磷酸酶,最初是由GuM 等人从巨核细胞 cDNA文库中克隆到 的l55I.其作为菲受体酪氨酸磷酸酶的一个成员,除了c端含有磷酸酶催化结构域外,还含有两个PEST序 列,两个脯氨酸富集序列,一个胰蛋白酶水解位点,一个PDZ结构域和一个FERM 结构域|6J.在 COS7细 胞系中,其过表达会抑制细胞增殖,降低细胞饱和密度,阻止克隆形成I.同时PTPN4与PTPN3结构相 似,并都在 胃癌组织中有高表达[.最近又找到了PTPN4的一个相互作用蛋白:谷氨酸受体GIuRd2j, 发现其在果蝇中脑的神经环路的形成中期起了重要作用,调控轴突投射模式的建立和稳定.其 FERM结 构域对大脑蘑菇体背支的保持是必须的,但对内侧支过度生长的阻止不是必须的.PTPN4有着复杂的生 物学功能[10],但是它起作用的分子机制仍然不清楚.本文利用酵母双杂交技术,以PTPN4为 诱“饵”筛选 人肝cDNA文库,寻找其特异性互作蛋白,对新发现的互作蛋白进行验证,并以互作蛋白为线索,进一步探 索其分子机制. 1 材料与方法 1.1 试剂和材料 ProQueStTMGal4酵母双杂交系统及人肝cDNA文库购 自美国 Invitrogen公司.尸矸w4基因的全长 cDNA克隆购 自武汉三鹰生物技术有限公司.TaqDNA聚合酶、DNA限制性内切酶、T4DNA高效连接试 剂盒、DNAMarker和pMD18一T载体购自TaKaRa(大连)公司.YeastExtract,YeastNitrogenBase(YNB) 收稿 日期:2008—02—29 基金项 目:国家高技术研究发展计划 “八六三”资助项 目(2006AA02A310),上海市科技创新 团队计划资助项 目 (03DZ14024) 作者简介:周 娟(1982一),女,硕士研究生;通讯联系人 霍克克,男,教授,E-mail:kkhuo@fudan.edu.cn. 第5期 周 娟等:CRK是 PTPN4新的相互作用蛋白 w /O,aminoacids

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