mincle受体蛋白克隆、原核表达与纯化【精选】.pdfVIP

现代食品科技 ModernFoodScienceandTechnology 2015，Vo1．31，No．3 MinoIe受体蛋白克隆、原核表达与纯化 严萍’，朱喜梅 ’，李璐 ’，林文华 ’，詹若挺 ’，唐语谦 (1．广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心，教育部岭南中药资源重点实验室，广东广州 510006) (2．华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 51064O) 摘要：本研究通过应用基因工程技术，构建融合基因pET14b．Mincle的原核表达载体，并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)~诱 导表达 目的蛋白Mincle，并对其表达产物进行纯化、鉴定、透析复性。采用RT-PCR技术扩增小鼠Mincle的基因片段，将其克隆于 载体pMD18一T中，并克隆到带有His-tag的原核表达载体pET14b中；重组质粒经酶切鉴定、序列比对验证正确后转化犬肠杆菌BL21 (DE3)中经IPTG诱导表达 目的蛋白。经 1mmol／LIPTG在37℃下诱导5h获得了分子量约为22kDa的重组融合蛋白的优化表达， SDS—PAGE、WesternBlot和ELISA证实了重组蛋白的特异性。Mincle以包涵体形式在宿主中表达，利用Ni亲和柱进行纯化和生物 膜透析复性，纯化和透析后的蛋白经WesternBlot、ELISA法定性鉴别以及用白色念珠菌 (SC5314)整个灭活细胞对复性后蛋白的活 性测定，透析后的Mincle重组融合蛋白能与白色念珠菌的特异性结合体现其生物活性，表明获得了具有活性的蛋白，为后续研究打 下基础 关键词：Mincle受体蛋白；基因克隆；表达；纯化 文章篇号：1673-9078(2O15)3—77。83 DOI：10．13982~．mfst．1673—9078．2015．3．014 Cloning，ProkaryoticExpression，andPurificationoftheM incleReceptor Protein YAN Ping，ZHUXi．mei，LILll1LIN Wen-hua，Z丑AN Ruo．ting，TANG Yul．qian ， (1．ResearchCenterofChineseHerbalResourceScienceandEngineering，KeyLaboratoryofChineseMedicnialResourcefrom Lingnna，MinistryofEducation，GunagzhouUniversityofChnieseMedicnie，Gunagzhou，510006，China)(2．SchoolofLight IndustryandFoodSciences，SouthChniaUniversiytofTechnology，Guangzhou510640，China) Abstract：In thisstudy,genetic engineering techniqueswere used to constructthe recombinantprokaryotic expression vector pET14b—Mincle，whichwasthentransformedintoEscherichiacolihostswainBL21(DE3)toinducetheexpressionofthetargetproteinMincle． Theexpressionproductwaspurified，verified，andrefoldedusingdialysis．Minclecoding sequencerfagmentswereamplifiedbyreverse trnascriptpolymerasechainreaction(RT-PCR)，nadclonedintothecarrierpMD18一Tnadtheprokaryoticexpr