牛分支杆菌和结核分枝杆菌基因芯片检测探针的筛选.pdfVIP

828蛞》2009年学术年会 T050078 牛分支杆菌与结核分枝杆菌基因芯片检测探针的筛选 林志雄1 贾 坤2 罗长保1鱼海琼1陈 茹1赵吟1谢凯英1李守军2 (1．广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心广州广东510623；2．华南农业大学兽医学院广州广东510642；) 摘要：结核病是常见的人兽共患细菌性传染病之一，给人类的健康以及畜牧业的发展带来了严重 的危害。牛结核病被世界动物卫生组织列为B类疫病，是进出境检验检疫中重点检疫的动物疫病之一。 且牛分枝杆菌还可以通过牛奶等途径感染人，因此对牛分枝杆菌及结核分枝杆菌的快速检测具有重要的 公共卫生学意义。材料方法：根据Gen．Bank和相关文献，选择牛分枝杆菌和结核分枝杆菌相对保守且 CGG GCT 特异的核酸序列应用Pl佃elPremier6．0软件各设计一对引物：mF：5-CAAGTG 5．0和Oligo CAAGT-3’，玎BR：5。一CTCGGTCTGGGTTTTCG一3‘：PMBF：5’一CTCAGCTGGTCATGTTCGCGA TGTGCCGGAGAA T-3’，PMBR：5-CGG GCC(3-3’。其中下游引物的5’端用荧光素Cy3标记修饰， 目的基因扩增产物理论值为234bp和294bp。针对该目的基因扩增产物的序列，各设计4条备选探针， 探针的核苷酸序列与PCR产物带有荧光的反向链互补，3’端氨基修饰，设计质控探针(QC)作为矩阵 7端HEX标记。探针和引物序列经BLAST分析确定其特异性。将标记的探 标志物，5喘经氨基修饰，3 针点至醛基化基片，制备基因芯片。采用引物不对称比例法PCR技术为基础，扩增目的片段，然后将 单链扩增产物与芯片杂交，杂交信号经扫描仪扫描后进行数据判读。实验结果：所设计引物能够将目的 片段有效扩增，筛选出的2条探针对阳性质粒进行实验性检测，能够有效的将两者区分，同时，芯片杂 交图谱差异不显著，具有良好的重复性。基因芯片是将大量的DNA片段按预先设计的排列方式固化在载 体表面，并以此作为探针，在一定的条件下，与样品中待检测的靶基因片段杂交，通过检测杂交信号， 实现对靶基因的存在、含量及变异等信息的快速检测，其优势是高通量、快速，特异性好，另外，采用 基因芯片的方法无需机体免疫应答反应，可以早期、准确地检测病原，这对于预防、控制疫情的扩散十 分重要该研究有望为进出境动物疫病快速、高通量基因芯片检测技术的建立奠定基础，具有广阔的应用 前景。本研究采用基因扩增技术，选取结核分枝杆菌以及牛分枝杆菌的特异序列并对其进行扩增，然后 针对特异序列的不同位置，设计多条探针，通过BLAST数据库进行在线比较，对设计的探针特异性进行 初步筛选，以确保所设计探针的特异性，针对每种菌各选定4条备选探针进行试验，通过杂交试验，最 终确定ptl、pml做为检测探针。该检测探针的筛选，为建立基因芯片检测结核分枝杆菌和牛分枝杆菌， 提供了重要的依据。通过进一步的研究，有望开发出基因芯片鉴别诊断牛分枝杆菌和结核分枝杆菌的新 实验方法。 参考文献(略)