基因工程两步酶法制备7-氨基头孢烷酸.pdfVIP

酶学与酶工程发展方向讨论会(2001年5月) 基因工程两步酶法制备7．氨基头孢烷酸 (中国科学院上海植物生理研究所) 杨蕴刘 作为最重要的抗感染药物，半合成B内酰胺类抗生素具有抗菌谱 广，毒性小，不易被B内酰胺酶破坏而对耐药菌株有效等特点，因此， 成为发展最为迅速，销售份额最大的一类抗生素。就头孢菌素而言， 国际医药市场已上市的品种多达五十余个。据对国内京、津、沪、粤 等十大城市典型医院的统计，年消耗量近十亿元。足见头孢菌素研究 和产业发展的重要性。 临床应用的头孢菌素类抗菌药物，均为半合成产品。工业上，先 C，CPC)，经 从顶头孢霉菌发酵液中提取头孢菌素C(Cephatosporin 化学或酶促裂解得到7一氨基头孢烷酸(7-arnino acid，7．ACA)，该中间体可与多种侧链缩合而成药用半合成头孢菌素。 目前，世界上对7一ACA的年需求量约二千吨左右。长期以来，一直 沿用化学方法，使CPC分子中7B位的氨基已二酰侧链裂解来制备7 吡啶等有毒化学品，故对技术，设备要求苛刻，能耗大，且存在严重 的环境污染和劳动防护等问题。因此，酶法转化CPC为7一ACA的 生物技术受到研究单位和产业部门的重视。 “基因工程两步酶法制各7一ACA”项目研究中，采用三角酵母 acid (Trigonopsis ACA(GL--7ACA)，在来源于Pseudomonas 化酶(GL一7ACA 得到反应终产物7一ACA。 已进行的研究工作和主要结果 株克隆获得并完成DNA序列测定。 2．通过细胞融合，所获得的三角酵母多倍体菌株的DAO产酶活力达 3500--4000u／升。 3．编码GL一7ACA酰化酶的gla基因在合适的大肠杆菌中高效表达， 每升发酵液产酶2500u，比母株提高100余倍。 4．构建了酶法工艺所需的工程菌宿主菌，其B内酰胺酶，过氧化氢 酶等杂酶的编码基因己被钝化，从而消除了副反应对转化过程的 影响，提高了转化效率。 5．在合适工艺条件下，以游离细胞或固定化细胞进行的两步酶法转 化CPC为7一ACA的生成率在70％以上，提炼后，产物纯度可 达96—98％。 6．建立了100升(批投料CPC4公斤)规模酶法制备％ACA的中试 生产线和相关工艺流程。 初步研究结果显示，通过采用两步酶法，由CPC生产7-ACA的 产业化前景良好，不仅符合环境保护和可持续发展的要求，而且有助 于母内酰胺类抗生素工业的总体水平提高和传统产业的升级改造，为 使项目更趋完善和具有国际竞争力，尚需对这一领域作更深入的研 究。 拟进一步研究的主要方面 1．包括D．氨基酸氧化酶，GL．7ACA酰化酶和CPC酰化酶在内的蛋 白质工程。 2．涉及表达系统选择和高表达相关的基因工程。 3．重组菌株的稳定性、生理学和发酵工程。 4．与制备固定化酶有关的酶提取、纯化和固定化技术的研究。 5．优化酶法转化CPC为7-ACA的工艺流程。 56