流感病毒NS1蛋白两个氨基酸协同突变增强病毒对小鼠致病性.pdfVIP

禽流感 流感病毒NSl蛋白两个氨基酸协同突变增强病毒对小鼠的致病性 蒲娟，王静静，张毅，傅光华，毕玉海。孙怡朋，刘金华 (中国农业大学。北京100193Email：Ijh@cau．edu．cn) I．前言 3．1鸭源H3N8流感病毒的生物学特性分离自 A型流感病毒非结构蛋白(NSI)是一个多功能 蛋白，在流感病毒感染过程中发挥重要的调节作用， 对小鼠的致病性明显不同。接种Dk／BJ／40／04的小 包括控制病毒特异性mRNA和病毒基因组RNAs模 板的合成，调控宿主细胞反应，以及通过与干扰素和 鼠在接种后第3天有3只(50％)小鼠死亡，在心、 干扰素诱导产生的蛋白相互作用，抑制宿主免疫应 肺、脑中分离到病毒；而Dk／BJ／6I／05组小鼠只表现 答。目前已有学者证实高致病性禽流感病毒NSI 出轻微的临床症状，接种后14天内无小鼠死亡，第 蛋白氨基酸突变或缺失能够影响病毒对不同宿主的 3天未分离到病毒。 致病性，然而，至今无人对低致病性禽流感病毒NSI 3．2NSI重排病毒的拯救以及对小鼠的致病性 基因的致病机制进行研究。本研究对两株毒力差异 两株野生型H3N8病毒NS2基因相同，而NSI基因 显著的H3N8鸭源流感病毒的NSI基因进行了序列编码的蛋白只有127，205。209三个位点的氨基酸不 比对，并进一步研究了NSI基因突变对病毒致病性 同。我们以WSN病毒为骨架，单独替换NS基因，拯 的影响。 2．材料和方法 61NSI)，这两株病毒对小鼠的致病性也存在明显差 2．1细胞和病毒马．达二氏犬肾细胞(MDCK)和异。 3．3 293．T细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基 NSI单突变株的致病性三株NSI单突变株 的毒力与WSN：61NSI相似，在鼠肺中病毒滴度很 中。H3N8鸭流感病毒A／duck／Beijing／40／04和A／ duck／Beijing／6I／05分离自北京活禽市场。 低，接种后小鼠未死亡，表明NSI蛋白127，205，209 2．2质粒的构建利用重叠PCR技术对NSI基三个位点氨基酸单独突变不能改变病毒的致病性。 因进行定点突变，并扩增全长的NS基因，将扩增得 3．4NSI双突变株的致病性NSI双突变株在鼠 到的cDNA插入基因表达质粒PLLB中。 肺中复制良好，并引起20．100％小鼠死亡。这些结 2．3拯救病毒利用反向遗传技术，以A／WSN／ 33(WSN)病毒为骨架，进行病毒拯救。转染48h后点氨基酸协同突变能够增强病毒对小鼠的致病性。 收获细胞上清，在MDCK细胞上连续传代两次，通过 3．5重组病毒在MDCK细胞上的生长特性三株 血凝实验和测序鉴定拯救得到的病毒。 NSI单突变株在MDCK细胞上生长情况与WSN： 2．4小鼠实验6周龄的BALB／c雌鼠，每只鼠滴 鼻接种50 106 104 胞上更快更好地生长，说明NSI蛋白氨基酸协同突 ttl EID50野毒或50肛lpfu的拯救病 毒，于接种后3天剖杀各组小鼠3只，取肺，脾，肾和 变能够增强病毒的复制能力。 脑进行病毒分离。每组剩余5只小鼠观察死亡率和 ◆考文献 50 体重变化。对照组经鼻接种PBStd／鼠。 【l】Min。J．Y．．L／．s．．Sen siteontheinfluenza 2．5病毒生长曲线用MOI=0．01的WSN病毒 G．C．，Krag，R．M．A