双向电泳与质谱技术分析类风湿关节炎滑膜细胞差异蛋白.pdfVIP

换所致。在受精卵发育阶段，若发生染色体不分离的现象，有可能产生由不同基 因型细胞组成的嵌合体，在检测STR基因座时也有可能出现三带型等位基因。 D5S818)都表现为三带型等位基因，且有2条“主带”(荧光强度高)、l条“次带” (荧光强度低)。后得知该个体有一个双胞胎兄弟，推测可能在子宫内胚胎间发生 血液交换导致三带型等位基因的出现。 目前在STR数据库中 D、PentaE、 型等位基因资料(包括Cordis系统的13个常染色体STR、Penta 还可能发现新STR三带型等位基因，但其产生的确切机制尚不明确。三带型等位 基因现象在亲子鉴定检案中比较少见。若在基因分型时出现此现象需引起重视。 首先应重复实验，包括标本提取、PCR扩增和电泳分析过程，以排除模板污染和 泳道渗漏等问题，然后再选用其它试剂盒进行验证。若确为三带型等位基因，应 加做其它STR基因座，以保证鉴定结论的科学性、准确性和可靠性。 双向电泳和质谱技术分析类风湿关节炎滑膜细胞差异蛋白 赵晓琴，李晓军，赵建宁，庞小娟，陈芳芳，虞伟，罗冰 (南京军区南京总医院临床检验医学研究所，210002) 目的类风湿关节炎(rheumatoidarthritis，RA)是一种受抗原驱动及T细胞介导的 全身性自身免疫性疾病，但其发病机制仍未完全明确，因而尚无满意的诊断方法和 治疗药物。人们希望能研究出一些检验方法，找到一些诊断标志物以助早期诊断。 近年来蛋白质组学技术的飞速发展，为研究疾病发病机制和发现早期诊断的分子 标记物提供了科学依据。由于RA主要病理特征是关节滑膜组织的炎性增生，RA 关节中成纤维样滑膜细胞(fibroblast-likesynovioeytes，FLS)的大量增生并在滑膜关 节重新分布是造成滑膜增厚的主要原因。此外，FLS可侵入软骨、肌键和骨骼， 通过释放一系列细胞因子和多种蛋白酶，进一步造成关节炎性破坏，FLS在炎症 反应和关节损伤过程中发挥关键性作用。因此，探索FLS在RA中的作用机制己 成为目前研究的热点之一。本实验用双向电泳(two．dimensionalgelelectrophoresis， assistedlaser 2-DE)和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(matrix desorption．ionization．time．of-flight 人关节FLS蛋白质表达差异，寻找RA关节滑膜特异性自身抗原，为RA的临床 早期诊断和药物靶点筛选提供可靠而灵敏的实验室参考指标。 方法取自经手术切除的滑膜组织，采用胶原酶／胰酶消化法分离培养FLS。选用 3．8代的FLS，裂解细胞获得细胞总蛋白，利用2-DE分离正常人及RA患者FLS 总蛋白质，凝胶经银染显色和ImageMaster图像数据分析识别差异蛋白质点， MALDI．TOF分析得到相应的肽质量指纹图谱，用Mascot查询软件搜索数据库， 对部分差异蛋白质点进行鉴定。 结果 1．光学显微镜下可见，滑膜细胞呈梭形或柱形，两极胞突细长，末端多与 邻近细胞连接并交织成网状，细胞核呈卵圆形，位于细胞中央，核仁明显，细胞 周围可见分泌物聚集。免疫组化染色结果显示胞浆Vimentin阳性，纯度为99％以 上，符合成纤维细胞的特征。2．RA患者和正常人滑膜细胞的2-DE图谱分别显示 出1633，1603个蛋白质点。对二者相互匹配的蛋白质点进行差异分析，按差异量 大于3倍的表达量进行分析，得出92个差异点，其中RA中表达上调和高丰度表 达的蛋白有33个，挑选在这33个点进行胶内原位酶解及肽质量指纹图谱(PMF) 分析，成功鉴定出30个点，其中有6个蛋白质分子己经被报道在RA中差异性表 达，另有24个是本研究新发现的具有潜在应用价值的分子标记物。根据数据库提 供的信息，鉴定的蛋白质按功能进行初步分类，主要涉及：①参与物质代谢或能 量产生的生物酶类，如肿瘤型丙酮酸激酶(M2．PK)，a．烯醇化酶(a．enolase)； ②细胞信号转导蛋白，如膜联蛋白(AnnexinAll)；⑨细胞结构蛋白，如核纤层蛋 白(Lamin．A／C)，核基质蛋白(NMP238)；④抗氧化蛋白，如微粒体热休克蛋白 (GRP75)，过氧化物酶(PRDXl)：⑤假定或未知蛋白，如PSME4。 结论RA患者与正常对照FLS间存在差异表达的蛋白质，这些差异蛋白有可能构 成RA关节滑