肝癌细胞凋亡抑制性消减杂交cDNA文库的构建和初步鉴定.pdfVIP

肝癌细胞翻亡抑制性消减杂交c嗍文库的构建及初步鉴定 161 肝癌细胞凋亡抑制性消减杂交eDNA文库的构建及初步鉴定 曾建新王文壳骆文静王知力 细胞凋亡是一个复杂的细胞自主性死亡过程，由一系列相关基因协调控制，这些基因被统 称为凋亡相关基因“·“。深人研究细胞凋亡相关基因有助于揭示肿瘤发生与发展中许多长期 困扰的难题，并可能为肿瘤的基因治疗开辟新的途径。我们用三氧化二砷(A8203)诱导人肝癌 subtracfive HCC一9204细胞凋亡，应用抑制性消减杂交Ⅲ(suppressim 建肝癌凋亡细胞的差异eDNA文库，以期克隆与肝癌细胞凋亡相关的基因。 材料和方法 【一)材料 system 养于含5％c02的培养箱中。曲A+RNA纯化试剂盒PolyATract1000为Pr∞咿公司 eDNA 产品；PCR—select 国Clutch公司产品；感受态大肠杆菌JMl09和限制性内切酶EcoRI购自宝生物公司；氨苄 PCR ce∞A^蔓P s)mte口 青霉素、x一耐、IFrG均为Gibco公司产品。PcR扩增仪为Perkm—Elmer 2400。 (二)方法 1．细胞凋亡谤导厦poly x10I l d，诱导细胞凋亡。分别收集约l pmoVL三氧化二砷(如饥)的培养基继续培养细胞2 ATract 1 A+RNA，作为消减杂 未凋亡和凋亡的肝癌细胞，按Poly By8tem000的说明书提取叫y 交的起始材料，利用紫外分光法和琼脂糖凝胶电泳鉴定所提取的曲A+RNA的质量。 2．eDNA合成按文献[3]方法进行，先取2腭poly(A)RNA，1m浓度为10pmol，L的cD· rain， NA合成引物，1mdNTP(10nm删L)在禽病毒反转录酶(AMY，20u)作用下于42℃反应90 合成eDNA第一条链。立即加入DNA聚合酶1、RNaseH、E DNA聚合酶6U，16℃反应30nlin，最终 体积为舯一的反应体系，16℃继续孵育2b，再加入T4 合成双链eDNA(dscDNA)。 3．接头(adaptor)链接合成的dseDNA于37℃下经R∞I消化1．5h，成为具钝性末端的 eDNA为试验 eDNA片段。以未凋亡的肝癌细胞dseDNA为参照方(driveI-)，凋亡的肝癌细胞ds 方(te8ter)，将t∞tercDNA分为两组，在T4 p盼2R)连接．16℃反应12h后进行连接效率检测。 eDNA各 作者单位：710032西安，第四军医大学病理学教研室 162 中国癌定研究搓展@ 1．5出，分别与1．5mdrivereDNA在68℃下杂交8h，反应结束后立即将两组testereDNA混合， eDNA 同时加人刚变性的driver1出，68t2下进行第二轮杂交，12h后终止反应。将经过二轮杂