酿酒酵母附加型分泌表达载体pYES2%2fCT%2fα-factor的构建和鉴定.pdfVIP

构建及鉴定 胡亚冬姚冬生 暨南大学微生物技术研究所，510632 cerevisiae)是一种最简单的单细胞真核生物。 酿酒酵母(Saccharomyces 它和人类关系密切，没有内毒素，无致病性，长久以来被用于食品和制酒行业， and 被美国食品和药物管理局(FoodDrug 全(GRAS)生物，用它表达的药物不需要进行大量的宿主安全性实验。因为酿酒 酵母与同为真核生物的动物和植物细胞具有很多相同的结构，又容易培养，加 上清晰的遗传背景和生理特性，酿酒酵母被用作研究真核生物的模式生物。1981 年Hitzeman首次利用酿酒酵母表达人干扰素基因获得成功，此后又有多种外源基 因在酿酒酵母中表达成功。酿酒酵母除应用于外源基因表达外，还是定向进化研 究最常用的真核表达宿主。 本研究把pPIC9载体上的信号肽(来自于酿酒酵母的a一交配因子即 分泌表达载体，得到一种高效的分泌表达系统，为外源蛋白在酿酒酵母中的分泌表 达和定向进化研究提供重要的载体材料。 300bp，利用DNA重组技术构建pYES2／cT／a-factor(pYCa)载体，构建图如图 l，测序比对结果如图2，比对结果完全一致，黄色标记为pYES2／CT的载体序列， 红色标记为新引入的多克隆位点，绿色标记为a-factor的最后一个密码子，表 Q)构建成功。利用pYC 明pYES2／CT／Q-factor(pYC a—man，以 共有的多克隆位点构建甘露聚糖酶(基因约1．3kb)的重组载体pYC 检测所构建质粒的稳定性和分泌能力。 重组载体通过醋酸锂法转化入酿酒酵母Invscl。重组子可在SC—U平板上生长． Q一腿n克隆连续转接培养，质粒连续表达6天 挑取Invscl／pYCa和Invscl／pYC Q—man a和InvscI／pYC 后仍具有很好的稳定性，结果如表l所示。挑取InvscI／pYC 克隆点植于加有曲利本兰和魔芋精粉的SC-U-Gal培养基上，连续培养72h后，结 a无水解圈产生，而InvscI／pYCa—man有水解圈产生， 果如图3所示，InvscI／pYC a—man a的信号肽可引导甘露聚糖酶表达在胞外。进一步分析InvscI／pYC 说明pYC 胞内和胞外酶活，以InvscI／pYCQ作对照，挑取2个克隆诱导培养至72h，同时 测定培养液上清及胞内提取物的甘露聚糖酶酶活，结果如表2所示，对照菌株的 两种酶活都未检测到，而Invscl／pYCa一舱n的2个克隆的胞外酶活分别为0．35 U／ml和O．42U／ml，而胞内酶活接近零。 Cl 的a-factor信号肽具有强而有效的分 通过上述三个实验可充分表明pYC 泌能力，可引导目的蛋白分泌至细胞外， a分泌载体是一种稳定、高 构建的pYC l55 散的分泌表达载体，可用于外源蛋白在酿酒酵母中的分泌表达，并为定向进化研 究提供一种真核分泌表达系统，更利于目的蛋白的检测和筛选，适于定向进化研 究高通量表达和筛选的需要。 ∞-，C00∞Mcc盯∞轴TnccC¨mTn虻碥? 渗～万 图】pYES2／CT／Q-factor(pYCa)的构建