猪巨细胞病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法建立与应用.pdfVIP

猪的传染病 猪巨细胞病毒 TaqMan 荧光定量 PCR 检测方法的建立与应用* 1,3* 1 2 2** 2 2 拜廷阳 ，赵德明 ，吴志明 ，闫若潜 ，赵明军 ，刘梅芬 （1. 中国农业大学动物医学院，北京海淀，100094；2. 河南省动物疫病预防控制中心，河南郑州，450008 ；3. 周口 市畜禽改良站，河南周口，466000 ） 摘 要 目的 建立一种特异、灵敏、快速检测猪巨细胞病毒的 TaqMan 荧光定量 PCR 方法。方法 根据 GenBank 已登 录的猪巨细胞病毒（Porcine Cytomegalovirus ，PCMV ）DNA 序列设计合成特异性引物对和 TaqMan 荧光探针，经优化 反应条件，建立了猪巨细胞病毒的 TaqMan 荧光定量 PCR 检测方法（fluorescent quantitative real-time PCR, FQ-PCR）， 进行了 FQ-PCR 检测方法的敏感性、特异性和重复性试验；对疑似 PCMV 感染临床样品进行了应用检测，并与常规 PCR 方法进行了比对；对 FQ-PCR 检测结果为 PCMV 阳性猪的不同内脏器官进行病毒含量比较检测。结果 成功建立 了PCMV 的FQ-PCR 方法，标准曲线的循环阈值（Ct 值）与模板浓度有良好的线性关系，相关系数为 0.998 ；检测灵 敏度可达 1 拷贝/µL ，是常规 PCR 的 100 倍；特异性高，对 pGEM-T/PCMV 重组质粒扩增呈现阳性反应曲线，而对 6 个对照病原的扩增曲线均呈现阴性反应；对不同浓度的 pGEM-T/PCMV 重组质粒分别重复扩增 6 次，重复结果良好； 对 15 份临床疑似 PCMV 感染的组织病料进行应用检测表明，其中有 9 份样品为阳性，与常规 PCR 方法检测的阳性符 合率为 100%。猪的内脏器管中PCMV 含量最高为扁桃体，最低的为小肠。结论 成功建立了 PCMV FQ-PCR 方法，可 用于临床上PCMV 感染猪的确诊和隐性感染猪的早期检测，对 PCMV 的快速诊断、综合防控及净化等具有重要意义。 关键词 猪巨细胞病毒；实时荧光定量 PCR ；TaqMan 荧光探针；检测；应用 巨细胞病毒（Cytomegalovirus, CMV ）是一类在自然界普遍存在而又有严格种属特异性的病毒， 属 β 疱疹病毒亚科，致猪发病的为猪巨细胞病毒（Porcine Cytomegalovirus, PCMV ），是一种条件性 传染病。该病毒首次从英格兰分离，是继伪狂犬病毒之后发现的第 2 个猪疱疹病毒[1] 。患猪特征性临 诊症状为食欲废绝，母猪繁殖障碍，表现为流产、死产、木乃伊胎、产弱仔等；仔猪有明显的眼炎、 鼻炎和肺炎症状，生长发育不良，增重差。本病毒分布广泛，大多数常规条件下饲养的猪群均存在 P CMV 感染，而且抗体阳性率都很高，但一般为亚临床型。自从 1955 年 Done 首次报道该病以来，在 英国、日本、德国、美国和澳大利亚等地区猪群的血清抗体阳性率大于 90 ％。在感染猪群中，血清抗 [2] 体阳性率高达 98 ％ ；近年来，猪群中PCMV 感染呈现上升趋势，且多与猪蓝耳病等混合感染，大大 加剧患猪的病死率[3] [4] 。在日本 1972 年就有本病病理学方面的报道 。随着器管移植技术的发展，PCM V 作为猪源病毒，对异种移植构成的潜在威胁也引起了相应重视[5,6,7] 。 建立 PCMV 的快速诊断方法对该病的早期诊断、防治及公共卫生等具有重要的意义。传统的病 毒分离方法需进行体外细胞培养增殖并观察细胞病变，但由于 PCMV 在体外增殖较困难，所需时间 长，费时费力，难以推广应用。因此建立猪巨细胞病毒快速、敏感、定量、特异的诊断方法非常必要。 目前，国内外有关PCMV 的研究报道较少，也缺乏相应快速定量的病原学诊断方法。荧光定量 PCR （Fluorescent Quantitative Polymerase Chain Reaction ，FQ-PCR ）检测方法具有操作简便、结果直观、