猪瘟病毒RT-Nested+PCR检测试剂盒研制及初步应用.pdfVIP

78 国家农业行业科技及国家生猪产业技术体系：第十二届全国规模化猪场主要疫病监控与净化专题研讨会论文集 猪瘟病毒RT—NestedPCR检测试剂盒的研制及初步应用 李宗华1，方奎2，罗勇2，熊 涛2，汤细彪1，尚书1，汤月季1，吴斌2’ 摘要：为向猪瘟净化工作和临床诊断提供一种灵敏度高、稳定性好的诊断方法，本文开展了猪瘟病 毒RT—NestedPCR检测试剂盒的研制，并对试剂盒质量进行了验证。结果显示，该试剂盒最低可检出约190pg 高了100倍。且特异性良好，批内和批间的试剂盒无差异，试剂盒在一20℃可保存12个月以上。在推广至各 级实验室试用过程中显示出了良好的可操作性，能适用于不同地区、不同条件的实验室快速检测猪瘟病毒。 关键词：猪瘟；RT—NestedPCR；检测试剂盒；研制 swine 猪瘟(classical 触性和致死性的传染病。目前在强大的疫苗免疫压力和复杂的病原流行等因素的影响下，该病的临床与病 理解剖表现趋于非典型化。而猪瘟病毒隐形感染所引起的繁殖障碍、仔猪先天感染与免疫失败已成为当前 猪瘟防控中的主要问题，由此引起的经济损失十分严重。为了有效地控制和根除猪瘟，临床亟需一种灵敏 度高，特异性好，一便于操作的诊断方法用于该病病原检测，特别是对种猪群隐性感染的检测。本文应需研 制了猪瘟病毒RT-NestedPCR检测试剂盒，并进行了验证及初步应用，现报道如下。 1材料与方法 1．1样品及毒株 18株猪瘟病毒质控毒株的核酸模板由中国兽医药品监察所提供；猪瘟兔化弱毒株(HCLV)细胞毒由武 所用的各种病原模板、可重复性试验所用的12份已知背景样品及120份扁桃体样品由华中农业大学动物传 染病诊断中心保存。 1．2主要试剂 物工程有限公司；引物合成自生工生物工程有限公司；无RNA酶的PCR管和EP管购自美国Axygen公司。 1．3病毒RNA的提取 1．3．1样本及阴阳性对照的处理 体等组织样品，剪碎，匀浆机碾碎或液氮研磨匀浆，按l：5的比例加入PBS缓冲液，充分混匀，反复冻融3 次，7500r／min离心5分钟，取上清备用： 国家农业行业科技及国家生猪产业技术体系：第十二届全国规模化猪场主要疫病监控与净化专题研讨会论文集 79 1．3．2 RNA的提取 采用常规的细胞裂解法(TRIZOL法)提取样品RNA。 1．4套式引物的设计与筛选 PCR检测方法。 1．5试剂盒的组成与制备 批30个，共150个试剂盒。 1．6试剂盒的使用方法 按试剂盒说明书使用。 1．7试剂盒的质量验证试验 1．7．1试剂盒的敏感性试验 剂盒进行扩增，以检测试剂盒灵敏度。 1．7．2试剂盒的特异性试验 采用试剂盒分别对18株猪瘟病毒质控毒株的核酸模板、我国猪场常发的病毒性和细菌性疫病的病原模 板进行检测，以验证试剂盒的特异性。 1．7．3试剂盒的可重复性试验 使用同一批次试剂盒的5个试剂盒，检测已知背景的12份样品，其中阴性样品6份，强阳性样品4份， 弱阳性样品2份，以验证该试剂盒批次内重复性。另外，使用3个不同批次的试剂盒对该12份样品进行检测， 以验证试剂盒批次间重复。 1．7．4试剂盒的保存期试验 12个月取出进行1次物理性状检验、无菌检验、敏感性检验和特异性检验。 1．7．5与国外报道的同类方法的符合试验 用本试剂盒与欧盟猪瘟参考实验室建立的猪瘟病毒RT-NestedPCR方法同时检测临床采集的120份猪瘟 扁桃体样品，以比较两种方法的符合率。 1．8种猪免疫猪瘟疫苗后扁桃体携带疫苗毒的规律摸索 30d，35d随机选取5头猪只进行扁桃体活体取样，采用本试剂盒检测猪瘟病原。从而确定检测采样最佳时 间，以便避开疫苗干扰。 1．9临床猪瘟感染情况的调查 gO 国家农业行业科技驶瑚家卡措产啦＆术障采·第1．目全吲规模化精自±要疰_南监牲b净化专题研讨台论史集 1 9 l规模化猪场种猪群猪痂{☆毒情况黼盘 从2009午王2叭0年．坩o#一¨地区6家规模化猪场种猪群活体采集扁桃体．采用丰试制盘进行猪瘟病朦 榆测。以丁解规攥化猜场种j荷耵赭缸带毒情况渊青。 1 9 2 l‰球技病猪猪瘟感染情况调盘 健卅本试刺盒对从毕巾农业大学动物传垫璃f≥断巾心收集的临床病料进行猪瘟病原检测，蛆调查猪瘟 感染在临球技柏猜一l，的比例．州叫检验试剂禽临床应州效果。 2结果与分析 2 I套式引物的设计与筛选 试驻时20十币同引物组合进行丁比