大肠杆菌融合表达系统地研究进展.pdfVIP

大肠杆菌融合表达系统的研究进展 程琰毛旭虎 大肠杆菌作为一种成熟的基因克隆表达受体， 被广泛用于分子生物学研究的各个领域，如基因分 个精氨酸组成。它已被成功用作细菌C末端标签， 离扩增，DNA序列分析，基因表达产物功能鉴定等。 带5个精氨酸标签的蛋白可通过阳离子交换树脂进 大肠杆菌表达系统具有遗传背景相对比较清楚，使 行纯化，大多数杂蛋白不结合树脂，结合在树脂上的 用安全，操作简便，周期短，经济等诸多优点，它的这 目的蛋白在碱性环境中通过不同浓度梯度的NaCl 些特点加上十多年外源基因表达的经验使其在大多 进行洗脱。多聚精氨酸可能会影响C末端区域为 数科研应用中成为高效表达异源蛋白最常用的原核 表达系统。尽管大肠杆菌有众多的优点，但并非每 年分析出Arg标签的火球菌属的糊精一麦芽糖结合 一种基因都能在其中有效表达，这归因于每种基因 蛋白的晶体结构，在视觉上此晶体与天然蛋白的晶 都有其独特的结构，mRNA的稳定性和翻译效率，体结构无差异，但与天然蛋白的晶体具有不同的衍 蛋白折叠的难易程度，宿主细胞蛋白酶对蛋白质的 射特性。C末端的精氨酸残基可通过羟肽酶B的酶 降解。外源基因和大肠杆菌在密码子利用上的差别 切作用而去除，此酶的应用已有许多成功的先例，但 以及表达产物对宿主细胞的毒性。在生命科学研究 此酶的应用会因酶切后的蛋白低产量和切割位点的 和生物制药、生物制品的生产中，不但要获得高产 非特异性而受到限制[33。 量、高纯度、高活性的产物，而且减少分离纯化的步 1．1．2组氨酸(His)融合系统 骤和成本也是十分必要的。融合表达载体为以上问 组氨酸(His)融合表达系统是目前应用比较广 题提供了有效的解决途径。融合标签最初作为一种 泛的蛋白表达纯化系统，利用此系统表达的重组蛋 有效的工具用于检测和纯化重组蛋白质，近年来的 白带有组氨酸(His)标签。多组氨酸亲和标签通常 研究表明，融合标签的作用并不局限于此，还具有提 位于重组蛋白的N端或C端，也可插入到信号肽及 高重组蛋白质的产量，增强重组蛋白的可溶性及稳 待表达的基因之间，标签的最佳位置具有蛋白特异 定性等多种作用。融合标签大致分为两类：一类为 性。组氨酸咪唑环作为电子供体通过与固定在亲和 小分子的肽标签，这些标签不会与融合的蛋白发生 层析柱上的过渡金属Ni2+形成配位键而牢固地结 干扰，使用最为广泛的有多聚精氨酸、FLAG、多聚合，基质材料洗涤之后，可通过调节柱缓冲液的pH 或者添加游离咪唑洗脱含多聚氨基酸序列的肽类。 组氨酸、S和StrepⅡ等。通常情况下这些小标签 无需去除。小标签对于融合蛋白的三级结构和生物 在变性条件下系统可对带6个组氨酸标签的蛋白质 活性的影响取决于标签的位置和氨基酸组成。另一 进行有效纯化，也可对带3个组氨酸标签的蛋白质 类为大分子的肽类或蛋白质，它们具有提高目的蛋 在生理条件下进行纯化。带6个组氨酸标签的蛋白 白表达，降低蛋白酶降解，促进目的蛋白的正确折 质可以在天然条件下，在低或高浓度盐的缓冲液中 叠，提高目的蛋白表达的可溶性等诸多作用，但这些 结合到Ni2+一NTA基质上，目的蛋白可用20～ 标签通常会影响目的蛋白的生物学活性并防碍目的 蛋白的后续研究如结晶等，因此这些标签必须加以 可减少带有组氨酸的宿主蛋白质的非专一性吸附。 去除。国内外诸多学者已对大肠杆菌融合表达载体 然而，咪唑的存在可能会对光谱实验、结晶实验产生 进行了深入研究并不断发现新的融合标签，使融合 影响并经常导致蛋白质的聚集。 表达载体更有利于外源基因的表达。本文对此领域 pET载体系统