病原性哈维氏弧菌对青石斑趋化性.pdfVIP

第六章疾病预防、控制与免疫 第四节病原性哈维氏弧菌对青石斑的趋化性 趋化性是有运动能力的微生物对多种化学物质的浓度梯度产生趋向或离避响应的 定向移动行为，在诸如感染的发病机制、在位生物除污、生物膜的形成等方面具有重 要意义…，因此，近年来关于微生物趋化性的研究得到部分学者的重视，Larsen等拉】 的研究表明矿。咿讹M对彩虹鲑，鳕鱼和比目鱼的鳃，体表及肠的黏液都具有趋化 性。El—Feki等¨o也发现寄生水霉对鱼类的代谢产物，鱼体组织中的氨摹酸，糖类及 脂肪酸具有趋化性是其寄生于宿主的重要因素。O1oole等Ho的研究则表明鱼类病原菌 鳗弧菌的趋化性是其感染宿主所必需的。由此可见趋化性是许多运动性病原生物毒性 的一个重要特点，病原菌的趋化性与致病性之间有着密切联系。然而，国内关于微生 物趋化性的研究报道尚不多见，且现有研究主要集中在环境微生物方面”“】，关于微 生物对鱼类的趋化性研究还未见报道。 哈维氏弧菌是海水鱼类养殖业中较为常见的一种条件致病菌，具有极生单鞭毛， 有运动性¨J，据报道该菌能引起海水网箱养殖的青石斑、尖吻鲈、刺鲷及巨石斑等多 种鱼类的弧菌病。由该菌引发的病害给世界各地的海水养殖带来重大经济损失，但对 其致病机制尚未了解。本研究以患病青石斑鱼分离到的病原菌哈维氏弧菌髑一628菌 株为研究对象，研究该菌对青石斑肌肉、血清、体表黏液和肠黏液及青石斑肌肉中18 种主要氨基酸的趋化性运动的特征和规律，从而对哈维氏弧菌的趋化性运动有一个初 步了解，为深入研究细菌在致病性方面的作用提供理论依据，为控制哈维氏弧菌感染， 提高青石斑的抗病性奠定基础。 一、材料与方法 (一)生物材料 菌株：哈维氏弧菌髑一628菌株分离自患溃疡病的青石斑鱼】。青石斑鱼：购自 厦门市第八市场，体质量300—500 g，鱼体健康活力良好。 (二)样品采集 青石斑表皮黏液和肠黏液的采集主要参照鄢庆枇喁。1的方法。 肌肉样品的制备方法为：无菌条件下取适量青石斑肌肉放人装有无菌甲Bs的匀浆 器中充分匀浆，4000 膜过滤，滤液用无菌PBs稀释至蛋白质含量为lo斗g／mL置一4℃保存备用。 血清采集：无菌条件下尾静脉采血，置一4℃待血清析出，取血清测蛋白含量后保 存备用。 (三)平板趋化实验 参照Khanna等的方法¨叫做适当修改，即细菌在r11SB液体培养基中生长至对数期， 4000 r／min离心10 513 从产量到质量——海水养殖业发展的必然趋势 同样速度离心，最后加趋化缓冲液振荡混匀制成菌浓度约1010CFU／mL的菌悬液。取 o．5mL该菌悬液加入培养皿中央并与冷却至约45℃的趋化培养基(含O．4％琼脂的 PBS趋化缓冲液)混匀，待凝固后在趋化平板中央加入待测样品200灿或氨基酸晶体 lOmg，置28℃温育，每隔2小时观察一次并拍照记录结果。 (四)毛细管趋化实验 1．对青石斑鱼表皮黏液、肠黏液、肌肉提取液及血清的趋化性 取灭菌的1．5mL离心管，分别加入表皮黏液、肠黏液等样品各0．5mL，并将上述吸 入菌悬液的毛细管插入离心管中的样晶中，置于28℃温育1h后取出，并将离心管 中的样品振荡混匀后取100斗L按10倍梯度稀释3次，每个稀释度取100灿涂布 ．IsA平板计数。 2．温度对哈维氏弧菌趋化性的影响 将吸入菌悬液的毛细管插入样品后分别置于15℃、18℃、22℃、25℃、28℃、 31℃和35℃下温育，其余操作同上。 3．pH对哈维氏弧菌趋化性的影响 余操作同上。 4．盐度对哈维氏弧菌趋化性的影响 其余操作同上。 5．哈维氏弧菌对青石斑肌肉18种主要氨基酸的趋化性 1．5mL离心管中加入的是质量浓度为5mg／mL的氨基酸溶液，其余操作同上。 6．氨基酸浓度对哈维氏弧菌趋化性的影响 加入离心管的氨基酸的质量浓度分别为5mg／mL、10mg／mL、20m∥mL、30mg／ mL、40 mg／mL，其余操作同上。 (五)数据处理 为区别随机运动与趋化性运动造成的误差，每次操作均设3组平行和对照组，对 照组1．5 mL离心管中加入的不是样品而是无菌的PBs趋化缓冲液，其他操作均相同。 获得的数据进行统计学