斑点叉尾鮰CC趋化因子SCYA117重组表达.pdfVIP

资源、王不境与可持续震展 斑点叉尾鲴CC趋化因子SCYAl17的重组表达 杨琳琳 上海海洋大学生命学院，上海，201306，yll-1983@163．tom 摘 基因表达迅速上调，提示趋化因子SCYAll7在细菌感染后的发炎过程中，起着比较重要的作用。为了今后进一 步了解趋化因子SCYAll7的功能，本文利用基因重组表达技术，在大肠杆菌低温菌株中，成功表达出了分子量 为42KDa左右的融合蛋白。通过不断对表达条件进行优化，可溶性的重组蛋白在1．0mmol／LIPTG诱导和12℃ 胞因子作用的离体试验打下了基础。 关键词：斑点叉尾鲷；CC趋化因子；重组表达；SCYAll7 刖吾 趋化因子(chemokines)是一类能趋化细胞作定向移动的细胞因子，是由小分子分泌蛋白 组成的一个大的细胞因子超家族，在病原体的清除、炎症反应、移植排斥、造血、血管生成、 肿瘤发生、HIV感染等过程中发挥着重要作用。根据其4个半胱氨酸残基的位置的保守性， 哺乳类中至今已鉴定出28个CC趋化因子的基因，其中在人类中鉴定出24个基因。CC趋化因 子家族是非特异性免疫系统的重要组成部分，由于其在高等脊椎动物的抗感染过程中，能招 募T细胞和巨噬细胞到藕原感染部位，激活和提高细胞的免疫反应，促进对病灶的修复过程 等起着非常重要的作用而引起关注。在鱼类中，也证实了某些CC趋化因子具有吸引巨噬细 胞到病原感染部位、增强巨噬细胞的吞噬能力。 是我国目前淡水鱼类出口的第二大品种，已在我国内陆20个省市有大面积的养殖(中国斑点 又尾鲴协会提供的数据)。斑点又尾鲴中共鉴定出26个CC趋化因子基因，分别被命名 基因在鳃、肝脏、头肾、脾脏等九个组织的表达分布进行了调查，Peatman等对感染爱德华 7 氏细菌感染后，CC趋化因子在头肾和脾脏中表达水平变化进行了初步的研究，发现SCYAll 1 基因在感染后的72小时内有明显的上调。为此，本研究对SCYAl7基因进行原核表达，表达 胞因子作用的离体试验奠定基础。 346 2009年上海研究生学术论坛 1． 材料与方法 1．1菌株与质粒 宿主大肠杆菌E．coli TOPl0由本实验室保存；克隆载体pGEM—TEasy购自Promega公 大学馈赠。 1．2工具酶与试剂 Marker BamHI和勋肛限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶和DNA DL2000均购自 天根：标签蛋白GST购自GenScrip+．司。 1．3实验动物 1．4斑点叉尾触SCYAll7基因的克隆 取斑点又尾触组织100rag左右，加液氮研磨，加lmL dT为弓l物反转录合成 RNA，按照说明书操作。以斑点又尾鲴脾脏总RNA为模板，vT,oligo accession eDNA第一链。以合成的eDNA第一条链作为模板，根据SCYAl17序列(Genbank I和SalI的酶切 No．DQl73291．1)设计引物进行RT-PCR扩增，上下游引物分别引),．BamH 位点。： BamHI Sall 扩增条件为：94C变性5 再94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环，最后72℃延伸10min，预期扩增产物长 度为300bp。用1％的琼脂糖电泳检测并回收目的片段，连接到pGEM-TEasy，转化入大肠杆 菌TOPl0，挑取阳性克隆PCR检测并测序。 l。5目的基因的原核重组表达载体的构建和鉴定 利用限制性内切