牛β—乳球蛋白基因5’调控成分的分离、克隆及序列分析.pdfVIP

维普资讯 第 31卷 第 3期 西北农林科技大学学报 (自然科学版) Vo1．31 No．3 2003年 6月 Jour．ofNorthwestSci—TechUniv．ofAgri．andFor．(Nat．Sci．Ed．) June 2003 牛 p一乳球蛋 白基因5调控成分的分离、 克隆及序列分析 石玉强，张 涌，郑月茂 ，刘建忠，张志平 (西北农林科技大学 生物工程研究所，陕西 杨陵 712100) [摘 要] 利用PCR方法克隆了牛 乳球蛋 白基因5调控成分(1449bp)，其中包括5侧翼序列 (645bp)，第 一 外显子及第一内含子 (804bp)。PCR产物回收纯化后 ，克隆在 pMD 18一TVector的T位点 。序列分析表明，该序 列与牛 乳球蛋 白A 型基 因、牛 乳球蛋 白B型基因、山羊和绵羊 乳球 蛋 白基 因的同源性分 别 为 98．55 ， 99．79％，9o．7o 和90．09 。计算机分析表 明，此调控成分含有诸多调节 因子结合位点或反应元件 ，其中包括视黄 酸反应元件 (RARE)、佛波酯反应元件 (TRE)、乳腺特异性因子 (MSBF)和核 因子 1(NF1)结合位点等 ，提示此调控 成分可调控外源基因在乳腺细胞中高效表达 ，可用于构建乳腺特异性表达载体。 [关键词] 乳球蛋白基因；牛；PcR；序列分析 [中图分类号] Q823；Q785 [文献标识码] A [文章编号] 1671—9387(2003)03—0001—04 利用乳腺生物反应器能大规模地生产人类所急 pMD 18一TVector购 自大连宝生物公司 。 需的外源活性蛋 白，该法因具有独特的优点而引起 试 剂和 仪 器 限制性 内切 酶 、T4连 接酶 和 人们的广泛关注。制备乳腺生物反应器最关键 的环 Marker均 购 自加拿大 MBI公司 ，TaqDNA 聚合 节是构建高效、特异的表达载体。 乳球蛋 白(13-1ac— 酶 、10×PCRBuffer和 dNTPMixture购 自大连宝 toglobulin，BLG)是反刍动物最主要的乳清蛋 白，大 生 物 公 司，DNA GelExtractionKit和 Plasmid 量研究证 明，它 的调控成分能指导外源基 因在乳腺 MiniprepsKit购 自上海生物工程公司。PCR仪为 细胞 中特异、高效表达。杨 国庆等[1]以牛BLG基 因 Ge neAmpRPCR—System 2400(美 国 PE公司)，凝 5调控序列作为启动子与人生长激素基因 (hGH)构 胶成像分析系统为英国UVPGDS8000型，紫外分 建表达载体，在转基因小 鼠乳清 中hC 的表达量为 光光度计为 Cintra(GBC)型 。 420mg／L。陈红星等L2]以牛BLG基 因5调控序列 1．2 方 法 构建表达载体，获得组织型纤溶酶原激活剂 (t—PA) 奶牛基 因组 DNA 的提取 奶牛颈静脉采血 ， 转基因鼠，t-PA在乳腺 中也有较高的表达量 。最引 0．5g／LEDTA抗凝 ，RNase酶 、蛋 白酶 K 消化后 ， 人瞩 目的是Wright[3]以绵羊BLG基因的5调控序 利用酚一氯仿法提取基 因组 DNA，真空干燥后溶于 列来表达 a1一抗胰蛋 白酶(al—AT)，a1一AT在转基因 绵羊乳 中表达量高达 35g／L。鉴于此，本试验拟 以