水翁花黄酮DMC诱导肝癌细胞SMMC―7721凋亡的机制研究.docVIP

水翁花黄酮DMC诱导肝癌细胞SMMC―7721凋亡的机制研究 　　[摘要] 目的：研究水翁花黄酮类化合物2′，4′-二羟基-6′-甲氧基-3′，5′-二甲基查耳酮（DMC）体外诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡作用及其分子机制。方法：采用改进的Sellins-Cohen方法检测不同浓度的DMC对SMMC-7721细胞DNA片段化的影响。用PCR-ELISA法测定肿瘤细胞的端粒酶活性，用半定量RT-PCR法测定c-myc和人端粒酶逆转录酶（hTERT）的mRNA表达量，Western blot法检测c-myc及hTERT蛋白的表达。结果：DMC作用于人肝癌SMMC-7721细胞后，引起SMMC-7721细胞DNA片段化率增大，片段化率效果有明显的浓度依赖性。与对照组相比，20 μmol?L-1DMC处理48 h后，肝癌细胞的端粒酶活性下降了（66.2±2.1）%。c-myc和hTERT 的mRNA表达水平分别下降了（67.3±2.1）%，（64.4±2.3）%，c-myc和hTERT 的蛋白表达水平分别下降了（69.6±1.9）%，（71.3±2.4）%。结论：DMC能诱导SMMC-7721细胞凋亡，其凋亡机制可能与c-myc基因和hTERT的mRNA以及蛋白的表达降低有关。 　　[关键词] 水翁花；凋亡；黄酮；肿瘤；端粒酶 　　[收稿日期] 2013-12-03 　　[基金项目] 浙江省自然科学基金项目（LY12C02002） 　　[通信作者] 叶春林，副教授，博士，主要从事天然产物的提取工艺及其生物活性的研究，Tel： （0571）E-mail： chlye2005@126.com 　　水翁花为桃金娘科植物水翁Cleistocalyx operculatus（Roxb.） Merr. et Perry的干燥花蕾，具有清热解毒，消食化滞的功效[1]，在民间使用非常广泛，也是“清热凉茶”中成药的主要原料。有研究报道，在小鼠心脏灌注系统中，水翁花提取物通过抑制Na+/K+-ATPase的活性加强了心脏的收缩功能，同时降低了心脏的收缩频率，因而推断水翁花中可能含有强心成分[2]。作者在前期的实验中，从水翁花中分离提取出了5个黄酮类化合物[3]，其中的主要成分为2′，4′-二羟基-6′-甲氧基-3′，5′-二甲基查耳酮（DMC）。抗肿瘤活性实验表明，DMC对人肝癌SMMC-7721细胞的增殖具有很强的抑制作用，Hoechst荧光染色、流式细胞术检测细胞亚G1峰结果说明DMC能够诱导SMMC-7721细胞凋亡[4]。但其具体作用机制尚不十分清楚。本实验通过考察DMC对人肝癌SMMC-7721细胞DNA片段化、端粒酶活性以及c-myc和人端粒酶逆转录酶（hTERT）的mRNA以及蛋白表达水平的影响，研究其对人肝癌细胞的凋亡作用及机制，为深入开发水翁花黄酮类化合物在抗肿瘤方面的潜力提供一定的实验和理论依据。 　　1 材料 　　1.1 药物、试剂与仪器 2′，4′-二羟基-6′-甲氧基-3′，5′-二甲基查耳酮（DMC）晶体（纯度98%）由本实验室制备获得[3]，临用时以少量DMSO溶解，再加培养液稀释至所需浓度，其中DMSO的终浓度0.01%；Trizol试剂，RPMI 1640培养基购自美国Life Technologies公司；小牛血清购自杭州四季青生物技术有限公司；逆转录试剂盒、PCR试剂盒购自上海生工工程有限公司；端粒酶活性测定试剂盒购自德国Roche公司。山羊源的抗action蛋白质抗体、鼠源的抗c-myc蛋白质抗体、兔源的抗hTERT蛋白质抗体购于美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG、兔抗山羊、山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；ECL-Western印迹检测试剂盒购自英国Amersham Pharmacia Biotech公司。XD202倒置显微镜购自南京江南永新光学有限公司；MK3酶联免疫检测仪购自美国Thermo公司；BB15 CO2培养箱购自德国Heraeus公司。 　　1.2 细胞株及细胞培养 人肝癌细胞SMMC-7721购于中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。用含10%小牛血清、100 U?mL-1青霉素和100 mg?L-1链霉素的RPMI 1640培养液，置于37 ℃恒温，5%CO2及饱和湿度的培养箱培养，每2～3 d传代1次。 　　2 方法 　　2.1 DNA片断化检测 参考Sellins-Cohen法进行DNA片段化分析，并做适当的改进[5-7]。用0～20 μmol?L-1梯度浓度的DMC作用SMMC-7721细胞48 h后，用0.25%胰蛋白酶消化离心，以PBS清洗2遍，1 000 r?min-1离心，收集细胞。用细胞裂