PCR-DGGE分子生物技术在环境工程中应用.pdfVIP

·146· 化 学 世 界 PCR-DGGE分子生物技术在环境工程中的应用 徐欢，何岩．黄民生 (华东师蓖大学环境科学系，上海200062) 关键词：多聚酶链式反应；变性梯度凝胶电泳；分子生物技术；环境工程 对于微生物的多样性及其生态功能的研究仅靠 序列，同基因文库中的16SrDNA序列比较，确定微 传统的微生物分析测定方法如显微镜微生物形态观 生物的种属。 察、选择性培养基计数、纯种分离和生理生化鉴定等 当单独的16SrRNA基因开始溶解时，迁移也 是远远不够的。因为微生物形态简单，缺乏明显的 会显示，并从PCR扩增物分开，通过变形梯度进一 外部特征；通过传统培养分离方法可分离出的微生 步迁移，这样可能导致双链的DNA变性，成为单链 物种类只占环境样品中微生物种类总数的0．1％～ DNA的混合产物。为了取得好的分离效果，在 10％。难以真实、全面地反映其中的微生物种群结 DNA片段上连接一个人工合成的富含GC序列 构和系统功能；此外，由于大多数自然环境中的微生 (GC-串)，长度为30～50个核苷酸的引物。这段极 物难于模拟其生长繁殖的真实条件．而不能获得纯培 稳定的额外序列容易附着到PCR的靶序列上，保持 养，使得根据生理生化特征对微生物进行分类鉴定 双股rRNA基因的完整性，这样DGGE才能最大化 也几乎是不可能的‘p．．近年来，将现代分子生物技 地将所有可能变化的序列检测出来。 术应用于研究环境中的微生物群体组成和结构功能 2基于PCR-DGGE的分子生物技术在环境工程领 是逐步发展起来的全新实验手段，其中基于PCR- 域的应用 DGGE的分子生物技术得到了广泛的应用。通过 PC融DGGE作为一种指纹分析技术，具有不需 这种实验搜术可有效避免传统培养、分离所造成的 要传统生物培养、检测极限低、快速和操作简便等特 微生物多样性的丢失、种群构成发生变化等问题，更 点，近年来在环境工程分子微生态研究方面得到了 能为快速准确地反映样品中微生物的真实情况浯31． 广泛的应用，主要应用于微生物种群结构及多样性 1 PCR-DGGE技术的原理 静态分析睁拍】、微生物种群动态研究[14-Z03以及特定 chainreaction-dena- PCIODGGE(polymerase 污染物的代谢过程研究和跟踪相关基因在环境中的 turinggradientgelelectrophoresis)称之为聚合酶表达口1。2孓]等。 链式反应一变性梯度凝胶电泳，Muyzer等人于]9932．1用于环境工程微生物种群结构及多样性静态 年首次将该技术应用于微生物群落结构研究。该技 分析 术的原理[‘J]是基于将16SrRNA的基因进行PCR微生物群落的种群多样性一直是微生物生态学 扩增，得到长度相同的片断，然后利用碱基序列存在 和环境学科研究的重点，同时也是环境工程系统评 差异的不同DNA双链部分解链时需要不同的变性 价重要参考内容。群落结构决定了生态功能的性能 剂浓度，序列不同的DNA片段就会在各自相应的 和强弱，其高稳定性是实现生态功能的重要因素。 变性剂浓度下变性，并发生空间构型的变化，导致电 通过对目标环境微生物群落的结构及多样性进行解 泳速度的急剧下降，停留在其相应的不同变性剂梯 析，可以为优化群落结构、调节群落功能和发现新的 度位置上，染色后可以在凝胶上呈现为分开的条带， 重要微生物功能类群提供可靠的依据。 如此便能将具有相同长度而序列有差异的DNA分 PCR-DGGE技术常用于如啤酒厂、酿酒厂。造 子分离开。 纸厂废水处理厌氧反应器内颗粒污泥微生物多样性 PCR-DGGE操作分为如下步骤：(1)从环境样 品中提取基因组DNA；(2)利用P