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中国康复医学会全国第八届运动疗法、第六届创伤康复学术会议论文汇编 诱导成鼠骨髓源神经干细胞的实验研究 杜劲松王剑张信英哈尔滨医科大学附属第一临床医院 脊髓损伤一直是困扰医疗界的难题，近年随着神经干细胞的发现与研究的深入，通过移植神经 干细胞恢复损伤脊髓功能成为可能，动物实验的结果令人鼓舞。充足的细胞来源是移植的基础，中 枢神经系统来源因数量有限和自体中枢神经系统取材可造成功能损害而难于应用于实践；胚胎来源 亦因伦理上的原因而一直存在争议；异体移植还存在不可避免的免疫排斥的问题。本研究拟探讨体 外诱导骨髓源神经干细胞及其增殖与分化。 材料与方法 8 1实验动物：成年雌性Wistar大鼠，l60—1 0 g，(本院实验动物中心提供)。 fibroblast growth factor，bFGF，Sigma)，表皮生长因子(epidermalgrowth (cytoseparation acidic Fibronectin抗体、神经胶质酸性蛋白(glialfibrillary 异性烯醇酶(neuronespecific Inc)。 5o j 截取双下肢长骨，DMEM／F12冲洗骨髓腔，获取骨髓液，加等量CMS梯度离心(20 r／m n， 1 5mi X1 0 5 重新悬浮，吹打均匀成单细胞悬液，台盼蓝染色后细胞计数，以5 5／ml接种于2ml培养瓶， 饱和湿度37℃、5％cOz孵育培养箱内培养，倒置相差显微镜下观察，待细胞球形成后，收集，于 新培养液中继续培养并行细胞免疫组化染色。 4骨髓源细胞球传代与单细胞克隆试验：收集原代培养的细胞球，机械分离成单细胞悬液，计 x1 0 数后，以5 0‘／ml接种于新培养瓶中培养；或稀释到1—2个细胞／1pl，滴加至96孔援， 0 每孔i u1，加新培养液至10 0 u1，置于孵育箱中培养，每天观察每孔中单细胞分裂及克隆形 成情况。 5骨髓源细胞球的诱导分化：将骨髓源细胞球接种于预置多聚赖氨酸包备玻片的24孔培养板 0天后行细胞免疫 中，加入含bFGFlOOng／ml的DbIEM／F12诱导分化培养液，置于孵育箱中培养，l 组化染色。 B 6神经干细胞培养：取成年Wistar大鼠海马皮层组织，PS漂洗，剪碎，0．25％胰蛋白酶3 xl 7℃消化15min，机械吹打成单细胞悬液，计数后以505／ml细胞密度接种于25ml培养瓶 机械吹打成单细胞悬液．行传代培养和单细胞克隆试验，并行细胞免疫组化染色。 5 7细胞免疫组化染色：4％多聚甲醛固定1min，滴加血清封闭液室温20min，滴加一抗 (Nestin1：100；Fibronectin1：100：CD90I：100：GFAPl：200：NSEl：100)，37℃60 7℃20min，DA min，滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，3 B显色，苏木素复染。