黄鳍鲷肌肉中肌联蛋白的纯化与性质分析.pdfVIP

噩宁·王畦 奎国啐痒t幡技术与喀沣焉格学术套议语文善 2006．8．2-6 黄鳍鲷肌肉中肌联蛋白的纯化与性质分析 杜雪莉”，苏文金 曹敏杰1 2 (1，集美大学生物工程学院厦门361021；上海水产大学食品学院， 上海， 200090) 肌联蛋白是一种弹性、高分子量蛋白质，分子量约为3000 kDalll。肌联蛋白是骨骼肌肌原纤维细 丝结构的重要组成部分，约占肌原纤维总量的8～12％。肌联蛋白将粗肌丝与z．线连接以维持肌原纤 维的完整性和稳定性，是骨骼肌中弹性蛋白的重要组成部分。 类的心肌和骨骼肌中先后分离到肌联蛋白p】。但在鱼类中有关肌联蛋白分离纯化的研究迄今为止未 见报道。 黄鳍鲷(Sparus 是我国海水鱼类养殖的重要对象。本文以海水黄鳍鲷为研究对象，旨在黄鳍鲷中提取并纯化肌联蛋白． 为进一步研究该蛋白在鱼类保鲜贮藏过程中的分解变化打下基础。 1材料与方法 1．1材料与试剂 冻存于-70℃冰箱待用。 S-400从Amersham Sephacryl serine (myofibril-bound 司购得，兔抗小鼠IgG．HRP从DAKO公司购得。其它试剂均为化学纯或分析纯。 1．2主要仪器及设备 高速冷冻离心机口eekman)；凝胶成像仪(Vilber 度计(Varian)t恒温水浴(Memmert)：蛋白电泳及电转移装置(Bio-Rad)等。 1．3方法 1．3．1肌联蛋白的提取与纯化 1．3．1．1肌联蛋白的粗提取 mM 以下整个过程在4C下进行。新鲜的黄鳍鲷背肌(约30g)，加入10倍体积的低盐缓冲液(10 Iris—maleate、0．1M mM mM mM KCI、2 EGTA、0．5DTT、O．1mMPMSF、2mM MgCl2、5 Na4P207， s，中间间隔l min．弃上 pH6．8)用组织捣碎机捣碎2次(每次不超过15 rain)，5,000rpm离心15 1次，搅拌10min后，5,000 rpm离心15rain，弃上清。再次将沉淀悬浮于10倍体积的低离子强度缓 冲液中，组织捣碎1次，不超过15s，离心后，弃上清，重复2次。50C下将沉淀溶于SDS缓冲液中 mM mMEGTA、40mM mM (10 Tfis-HCl、3％SDS、5 DTT、2 8．O)，搅拌20rain后，离 PMSF，pH 心，收集上清。 S-400的柱层析 1．3．1．2肌联蛋白的Sephacryl 取上述制各的上清液7．5 mMTris．HCI、0．1％SDS、20 mL上样于用缓冲液(40 mM乙酸钠、5 mlvlEGTA、0．1mlvl S-400(】5x98 mL。 DTT．pH8．0)平衡!均Sephacryl em)凝胶过滤柱，每管收集l 测定蛋白质的A280值并进{YSDS．PAGE检测。 1．3．2免疫斑点印迹法(Dot．blot)检测 将纯化的肌联蛋白按一定比例稀释，在硝酸纤维紊膜上点样。待膜干燥后加入5％脱脂奶封闭lh， 而后与小鼠抗鸡肌联蛋白单克隆抗体(1：1000)反应2