单细胞逆转录PCR实验方法研究.pdfVIP

引起的以微管为靶位化疗药抵抗中发现伴有fhit表达量的相应改变。 二、肪豇基因的失活形式 大量的研究表明约70％的人类肿瘤中都存在．[hit基因的改变，如：肺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱 癌等，基因改变的形式包括等位基因缺失、异常转录本、57端启动子区域的CpG岛发生异常甲基化等。 1．等位基因缺失：LeeYC等17 检测58例原发性非小细胞性肺癌，87．7％的样品一个以上标志部位出现杂合子缺失(10ssof 还发现thit基因LOH和p53高表达具有和好的相关性。SongLY等[sl用三个微卫星标志物(D3S1234， 小于1年的未检测出LOH(0／70)；而肿瘤样本85％存在历ff基因LOH。 C 2．异常转录本：应用RT-PCR技术，在许多肿瘤组织和细胞株中检测到异常的历ff转录本。Tzao 等19l检测了129例非小细胞肺癌组织样本，20％存在异常转录本，缺失主要是外显子4～8。LeeSH等f101 用巢式RT-PCR检测6个胃癌细胞株，发现存在各种异常转录的mRNA，包括外显子缺失，插入部分内 含子序列等。 C等f9l研 3．5’CpG岛发生异常甲基化：启动子区域5’CpG岛发生异常甲基化会引起基因沉默。Tzao 究发现3l％样本存在CpG岛发生异常甲基化，并且经常和异常转录本同时存在的。DhillonvS等【…应用 甲基化。 三、#／t基因和肿瘤的发生及治疗的关系 1．fhit基因和肿瘤的发生： 鼠N．nitrosobis(2．oxopropyl)．amine(BOP)诱发肝内胆管细胞癌，一次给予雌性大鼠70mg／kg后，给予缺乏 例肝内胆管细胞癌，通过RT-PCR证实28．6％(4／14)存在fhit基因表达缺失。LubetRA等114J给予雄性 32周后，32％的小鼠可触及肿瘤生长，免疫组化证实肿瘤组织fhit基因低表达而正常组织高表达。Zanesi 2．历ff基因和辐射：DanoL等【M】研究发现，在吸入氡气所致的大鼠肺癌中频繁地发生．[hit基因缺失， 其缺失的类型同人肺癌和腺瘤中发生的#it基因缺失类型相似，提示#／t基因可能参与辐射致癌的过程。 我室利用60C吖射线照射BALB／c小鼠诱发自血病制成辐射致癌动物模型，在照射后早、中、晚期均检测 出异常转录本(未发表资料)。可见Jhit基因参与了辐射诱导的肿瘤形成过程。 3、历ff基因和肿瘤治疗：／hit基因抑制肿瘤的活性使利用腺病毒载体或腺病毒相关载体导入外源性)Chit 基因来预防和治疗肿瘤成为可能。Dumon等【181利用腺病毒载体和腺病毒相关载体将夕卜源性fhit基因导入 发生。lshii等㈩研究表明外源性yhU基因导入不仅可以有效预防，而且可以逆转已经产生的肿瘤。 单细胞逆转录PCR实验方法研究 熊杰韩玲朱丹 第二军医大学海军医学系放射医学教研室上海200433 f摘要l 目的：探索建立稳定可靠的单细胞逆转录PCR实验体系。方法：以SV40病毒转染的永生化 人支气管上皮细胞株(BEAS--2B)为实验对象，制备单细胞悬液后，在倒置显微镜下用微吸管吸取单个 i78 性扩增挚个细胞中的全部mRNA，通过各个环：H上实验条件的比较优化，对这两种单细胞逆转录PCR方‘ 法的扩增效果进行了深入的研究，并通过琼脂糖凝胶电泳和DNA测序技术，分析了该方法的灵敏性、特 异惚、重复性和忠实性。结果：优化确定了各个环‘H的实验条件，建立了稳定可靠的单细胞RT-PCR实!缝 增产{|_{：可达Lig水iF，足够其他常规研究所刖：各组对照显示整个实验过程没有受到外源性DNA污染， 同州丛冈组DNA在陔程序中也不能被扩增。结论：证实单细胞RT-PCR具有很好的灵敏性、特异性、委。 夏性和忠实性。建立了稳定可靠的单细胞逆转录PCR实验体系，为单细胞水平上基因表达研究提供了强 有力的I：具。 l关键词1单细胞；逆转录；PCR：mRNA 发育、细胞生长、分化和癌变等过程与全基因组表达的选择性激活和时空调节密切相关．因此这些过 程中基【]；j表达模式的改变已成为当今生物